《Clinical Epigenetics》：DNAm landscape up to 4 months post SARS-CoV-2 infection: insights from four population-based cohorts
编辑推荐：
背景：关于轻症SARS-CoV-2感染者是否存在持续性表观遗传改变的的证据有限，现有DNA甲基化(DNA methylation, DNAm)研究多聚焦于急性期或需住院重症病例的恢复期。方法：研究人员利用Infinium Human MethylationEP
背景：关于轻症SARS-CoV-2感染者是否存在持续性表观遗传改变的的证据有限，现有DNA甲基化(DNA methylation, DNAm)研究多聚焦于急性期或需住院重症病例的恢复期。方法：研究人员利用Infinium Human MethylationEPIC BeadChip（甲基化芯片），在ORCHESTRA联盟框架下分析了来自四个基于人群队列（NAKO、Lifelines、CON-VINCE及TiKoCo；n=675）中SARS-CoV-2感染者（感染后≤4个月）与年龄性别匹配对照者的外周血DNAm。结果：发现16个差异甲基化位点(differentially methylated positions, DMPs)及21个差异甲基化区域(differentially methylated regions, DMRs)，其中89%在病例中呈低甲基化(hypomethylated)。这些CpG位点关联基因经基因本体论(Gene Ontology, GO)注释富集于病毒感染免疫应答通路。在独立队列KORA FF4中进行expression quantitative trait methylation(eQTM)分析得到49个显著CpG–转录本对，包括IFI44L和GNA12。尽管存在个体间变异及队列异质性，四个DMPs（IFI44L、MX1、DDX60、RABGAP1L）及两个DMRs（PARP9、GNA12）的甲基化改变与急性及长期随访中报道的变化一致。其他新位点的差异甲基化可能反映感染后系统性表观遗传改变。结论：轻症社区人群SARS-CoV-2感染后长达4个月存在中度但持续性的表观遗传改变，部分镜像急性期改变并重叠自身免疫、代谢及神经疾病中失调通路。未来应探究与长COVID(long COVID)持续症状相关的表观遗传改变、DNAm对其他组学(omics)的下游效应及更长随访期以阐明机制。
本文对发表于《Clinical Epigenetics》的一项大规模表观基因组关联研究（Epigenome-Wide Association Study, EWAS）进行解读。既往SARS-CoV-2感染的DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）研究多集中于急性期或重症住院患者恢复期，轻症社区人群是否存在持续性表观遗传重塑尚缺乏大样本证据，且轻症与急性期改变的相关性、是否持续数月未明。为此，研究人员联合欧洲ORCHESTRA联盟下四个基于人群的前瞻性队列，对未接种疫苗、感染后4个月内轻症康复者及匹配对照者进行全血Illumina MethylationEPIC芯片检测，旨在表征轻症SARS-CoV-2感染长达4个月的外周血DNAm景观及其与已知免疫通路的关联。
研究人员采用的主要关键技术方法如下：样本来源于德国NAKO、荷兰Lifelines Corona、卢森堡CON-VINCE及德国TiKoCo四个基于人群队列，共纳入675名18岁以上未接种新冠疫苗、感染4个月内（血清学阳性和/或自报阳性PCR/抗原检测）的轻症病例及年龄性别匹配对照；从全血或提取基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化后使用Infinium Human MethylationEPIC BeadChip检测约85万CpG位点，质控后保留683,653个CpGs；用minfi包按CPACOR流程进行背景校正与分位数归一化(quantile normalization)；用FlowSorted.BloodExtended.EPIC进行白细胞组成反卷积(estimateCellCounts2)估算12种白细胞比例并纳入协变量；各队列分别拟合线性回归模型（CpG β值~病例状态+年龄+性别+11个白细胞比例+技术变量），后用METAL做固定效应(fixed-effects)与随机效应(random-effects)荟萃分析，Bonferroni校正阈值p<7.48×10??；用comb-p鉴定差异甲基化区域(differentially methylated regions, DMRs)；用missMethyl做GO/KEGG富集分析；用独立KORA FF4队列RNA-seq与DNAm数据做表达数量性状甲基化(expression quantitative trait methylation, eQTM)分析；做leave-one-out敏感性分析及仅血清学确诊亚组分析。
Cohort description
四队列共675人，年龄41–57岁，男女均衡，病例与对照组吸烟率、BMI及慢性病史无显著差异；白细胞反卷积仅NAKO中病例嗜碱性粒细胞略高，余无组间差异。
Epigenome-wide association analysis (EWAS)
各队列单独EWAS基因组膨胀因子λ=0.931–1.007无需GC校正；Lifelines中发现cg13452062与cg03607951（均锚定IFI44L）达Bonferroni显著性，其余三队列未达全基因组显著。
Meta-EWAS results
荟萃分析发现16个 suggestive显著CpGs（p<1×10??）锚定于12个基因，其中3个位点达Bonferroni显著性——cg03607951（IFI44L，效应=-0.024，p=1.50E-09）、cg24678928（DDX60，效应=-0.017，p=6.37E-09）、cg19397320（BTBD3，效应=-0.005，p=6.21E-08）；75%为病例低甲基化，多数位于启动子区（TSS1500/5'UTR/第1外显子）；方向各队列一致，调整吸烟及慢病后效应略减弱仍显著，血清学确诊亚组分析重现结果且异质性降低。
DMR results
meta分析鉴定21个Sidak显著DMRs（p<0.05）含101个CpGs，覆盖10个蛋白编码基因及2个假基因，全部为病例低甲基化且与DMP方向一致；敏感性分析得8个稳定DMRs，其中DMR锚定PARP9与GNA12在单个队列中有复制。
Enrichment analyses and annotation
117个DMP/DMR关联CpGs注释至22个蛋白编码基因，GO富集最显著条目为"对病毒感染的应答(response to viral infection)"，KEGG涉及免疫炎症疾病；IFI44L、MX1、MAPK8参与SARS-CoV-2感染WikiPathways(WP5115)；部分基因具免疫细胞特异性表达；与系统性红斑狼疮及HIV免疫控制表观特征高度重叠；少数CpGs存在methylation quantitative trait loci(meQTL)。
Association between DNA methylation and gene expression
KORA FF4中eQTM鉴定49个CpG–转录本对（69.39%为负相关即低甲基化伴高表达），cg03607951(IFI44L)低甲基化与IFI44L高转录强负相关；DMR4(GNA12)内所有CpGs低甲基化与GNA12高表达负相关；DMR10(PARP9)内CpGs低甲基化与PARP9、PARP14、DTX3L高表达正相关。
讨论总结
本研究是迄今最大规模基于人群队列评估SARS-CoV-2轻症感染后≤4个月全血DNAm改变的EWAS（n=675，四国队列）。发现16个DMPs与21个DMRs，89%DMRs及多数DMPs在感染者中呈低甲基化，三位点达全基因组显著——最强信号为cg03607951(IFI44L)、cg24678928(DDX60)、cg19397320(BTBD3)；DMR中最稳健者为PARP9与GNA12所在区域且获eQTM支持。这些干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)（IFI44L、MX1、DDX60）及PARP9、GNA12的低甲基化改变与急性期COVID-19及更长期随访报道一致，提示部分急性感染诱导的表观遗传修饰可在轻症社区人群中持续数月。富集分析示关联基因参与I型干扰素通路及病毒免疫应答，并重叠系统性红斑狼疮、干燥综合征等自身免疫病通路，提示先天免疫系统共同失调。白细胞比例校正后关联仍稳健，调整吸烟及慢病影响微小，血清学确诊亚组与leave-one-out敏感性分析验证结果稳定性。研究局限性含采血距感染时间跨队列变异、部分队列靠自报确诊、横断面设计无法纵向追踪及未关联长COVID症状，但排除疫苗接种干扰并具欧洲多中心代表性。
结论（翻译）
本研究表明轻症SARS-CoV-2感染者在基于人群队列中存在持续长达4个月的中度但具持续性的外周血DNA甲基化改变。这些改变部分镜像急慢性COVID-19中报道的改变，并与炎症、代谢及免疫失调通路重叠。研究人员确认了先前报道的IFI44L、MX1、DDX60、PARP9及GNA12关联并识别值得深究的新区域。未来纵向研究应结合DNAm与其他组学数据探究表观遗传改变的下游效应及随时间演变，并收集感染后持续临床症状以阐明SARS-CoV-2诱导的长程表观遗传改变在新冠后遗症(post-acute sequelae of SARS-CoV-2 infection, PASC/long COVID)中的分子机制。
