《Journal of Translational Medicine》：The oral microbiome is associated with the diagnosis, prognosis and radiotherapy sensitivity of esophageal cancer
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摘要背景
食管癌（EC）是全球范围内癌症相关死亡的重要原因之一，亟须建立早期检测策略和精准术后干预方案。然而，用于诊断和预后判断的非侵入性生物标志物鉴定仍较为有限。
摘要方法
研究人员对440名受试者的舌苔样本进行了16S rRNA基因测序，其中包括
摘要背景
食管癌（EC）是全球范围内癌症相关死亡的重要原因之一，亟须建立早期检测策略和精准术后干预方案。然而，用于诊断和预后判断的非侵入性生物标志物鉴定仍较为有限。
摘要方法
研究人员对440名受试者的舌苔样本进行了16S rRNA基因测序，其中包括157例EC患者、167名健康对照（HCs）和120例接受放疗的EC患者。研究人员对口腔微生物组进行了表征，并构建了微生物诊断与预后分类器。此外，还对接受放疗的EC患者的口腔微生物组（n?=?120）进行了特征分析。
摘要结果
EC患者的口腔微生物多样性升高，且其微生物群落与HCs之间存在差异。在EC中，Veillonella、Streptococcus和Actinomyces属富集，而Porphyromonas和Rothia属耗竭。基于6个最优微生物标志物，研究人员采用随机森林算法构建了分类器，在发现组和验证组中分别获得了93.69%和95.18%的曲线下面积（AUC）。放疗后，口腔微生物多样性和丰富度显著下降。包括Fusobacterium和Porphyromonas在内的机会致病菌丰度下降，而Streptococcus和Actinomyces在放疗后的EC患者中丰度升高。经过6个月随访后，依据肿瘤复发、转移和死亡情况，患者被划分为进展组（PG）（n?=?26）和非进展组（NPG）（n?=?106）。研究人员构建了一个基于口腔微生物组13个筛选扩增子序列变体（ASVs）的预后模型，其AUC为99.29%。随机森林分析鉴定出PG与NPG之间6个关键差异ASVs，其中包括Fusobacterium和Gemella。此外，还鉴定出与9项临床指标相关的25个ASVs。
摘要结论
本研究系统刻画了EC患者及放疗后EC患者的口腔微生物组特征，强调了口腔微生物组作为判断EC诊断和预后的非侵入性生物标志物的潜力。
该研究发表于《Journal of Translational Medicine》，围绕食管癌（EC）的非侵入性检测与预后评估展开，核心问题在于：当前食管癌早期筛查主要依赖内镜，但内镜具有侵入性、成本较高，限制了其大范围应用；同时，临床预后判断在很大程度上依赖肿瘤部位、TNM分期和组织病理学等传统指标，准确性和一致性仍有限。因此，寻找稳定、便捷且具有临床转化价值的非侵入性生物标志物，既有助于早期发现，也有助于放疗后风险分层与精准干预。近年来，口腔微生物组被认为参与炎症调控、免疫反应和肿瘤相关信号改变，并与多种局部及全身疾病相关，但在食管癌中的研究仍面临样本量偏小、缺乏独立验证队列等不足。基于此，研究人员以中国中原地区这一食管癌高发区域为研究场景，系统分析舌苔口腔微生物组与食管癌诊断、放疗后变化及短期预后的关联，以评估其作为临床生物标志物的可行性。
在技术方法方面，研究采用前瞻性样本收集与回顾性盲法评估设计，纳入河南省郑州大学附属肿瘤医院受试者共440份舌苔样本，包含EC患者、健康对照（HCs）以及放疗后EC患者。研究人员通过16S rRNA基因V3-V4区MiSeq测序，结合DADA2算法获得扩增子序列变体（ASVs），并使用α多样性、β多样性、LEfSe、Spearman相关分析、PICRUSt2和MetaCyc/KEGG功能预测进行群落结构和潜在功能评估；同时采用随机森林和随机生存森林（RSF）构建诊断模型与预后模型，并在发现队列和验证队列中评估曲线下面积（AUC）。
**Patients, data collection, and study design**
研究共前瞻性收集440份舌苔样本，最终纳入157例EC患者、167名HCs以及120例放疗后EC患者。研究将EC与HC样本按7:3随机分为发现阶段与验证阶段，在发现阶段进行口腔微生物组特征分析并筛选关键微生物标志物，随后在验证阶段检验诊断模型效能。此外，研究比较了放疗前非放疗组（NRT）与放疗后组（RT）的口腔微生物动态变化，并对132例具有6个月随访结局数据的患者进行机器学习分析，构建预后模型。该设计使研究同时具有横断面分析和纵向观察特征，为诊断与预后评估提供了连续证据链。
**Baseline characteristics of the study cohort**
在发现队列中，EC组与HC组在年龄和性别方面匹配良好，差异无统计学意义。相比HC组，EC组中性粒细胞计数（NEUT）升高，而淋巴细胞计数（LYMPH）、单核细胞计数（MONO）、血红蛋白（HGB）和白蛋白（ALB）水平下降。这些基线临床特征提示EC患者存在一定程度的炎症反应增强及营养/免疫状态改变，也为后续口腔微生物与临床指标的相关性分析提供了背景支持。
**Characterization of the oral microbiome of EC patients**
研究首先系统刻画了EC患者的口腔微生物组失调特征。Venn分析显示，EC组与HC组共享1578个ASVs，但EC组独有1245个ASVs，提示其微生物组成更复杂。α多样性分析表明，EC组的Chao 1指数、Ace指数和Shannon指数均显著升高，说明EC患者口腔微生物丰富度和多样性增加。β多样性分析中，基于未加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）均显示EC组与HC组微生物群落明显分离，Adonis和ANOSIM检验进一步证实组间差异显著。这说明食管癌患者存在明确的口腔微生态失衡。
在群落组成上，两组共同的优势菌门主要为Firmicutes、Bacteroidota、Proteobacteria、Actinobacteriota和Fusobacteriota。属水平分析显示，EC患者中Veillonella、Streptococcus和Actinomyces等59个菌属富集，而Porphyromonas、Rothia和Haemophilus等13个菌属减少。LEfSe分析进一步筛出与EC相关的代表性差异菌群，热图和随机森林分析则在ASV层面提示Streptococcus、Gemella、Prevotella和Fusobacterium等菌群具有较强区分能力。总体而言，本部分结果表明EC患者口腔微生物组在结构和组成层面均出现系统性改变。
**Machine learning-derived biomarker panel for diagnosing EC patients**
在明确EC相关口腔菌群特征后，研究人员进一步构建诊断模型。研究通过随机森林模型结合五折交叉验证，从发现队列中筛选出6个最佳ASV标志物，并建立6-oral microbiome diagnostic model（6-OMD模型）。该模型在发现队列中能够显著区分EC患者与HCs，POD（probability of disease）指数在EC组显著升高，ROC分析显示AUC达到93.69%。在独立验证队列中，模型仍表现出良好的泛化能力，AUC达到95.18%。这一结果说明，基于舌苔口腔微生物组的机器学习模型具有较高的敏感性和特异性，可望发展为EC的非侵入性辅助诊断工具。研究还指出，Alloprevotella和Prevotella对模型贡献较大，显示特定菌群在疾病识别中具有突出价值。
**Dynamic changes in the oral microbiome of EC patients before and after radiotherapy**
研究进一步比较了EC患者放疗前后口腔微生物组的动态变化。Venn图显示RT组和NRT组共享2026个ASVs，但NRT组独有683个ASVs，而RT组独有229个ASVs。α多样性分析显示，RT组的口腔微生物多样性和丰富度显著低于NRT组；PCoA和NMDS分析则表明放疗前后口腔微生物群落分布存在显著差异。这说明放疗与口腔微生态重塑密切相关。
进一步的分类学分析显示，RT组优势菌属为Streptococcus，而NRT组优势菌属为Neisseria。与NRT组相比，RT组共有45个菌属发生显著变化，其中41个菌属下降，包括Fusobacterium和Porphyromonas等机会致病菌；而Streptococcus、Actinomyces、Corynebacterium和Pediococcus升高。差异菌群分析和LEfSe分析均证实放疗前后微生物谱显著不同。该结果提示，放疗不仅影响肿瘤本身，也可能通过改变口腔微生态环境与宿主状态相关联，其中机会致病菌减少可能与疾病恢复有关。
**Oral microbial characterization of the PG and NPG**
针对预后分析，研究基于6个月随访结果，将132例EC患者分为进展组（PG）和非进展组（NPG）。结果显示，两组在口腔微生物总体多样性和丰度上差异不显著，PCoA和NMDS也未能清晰区分两组，说明单纯依赖整体群落多样性难以反映短期结局差异。然而，属水平和ASV水平分析发现了与疾病进展相关的特异性变化。与NPG相比，PG中Fusobacterium、Eubacterium_nodatum_group、Lachnospiraceae_uncultured和Filifactor等4个菌属减少；随机森林进一步鉴定出6个关键差异ASVs，包括Fusobacterium和Gemella。研究还通过Spearman相关分析发现，25个ASVs与9项临床指标相关，包括白细胞计数（WBC）、中性粒细胞（NEUT）、血小板（PLT）、血红蛋白（HGB）、肿瘤分期、吸烟、淋巴细胞（LYM）、单核细胞（MONO）和白蛋白（ALB）。这表明，尽管总体群落差异不明显，但某些特定微生物变化与食管癌进展及临床状态密切相关。
**A prognostic model based on the oral microbiome accurately predicts 6-month outcomes in EC patients**
在识别到预后相关菌群后，研究人员进一步建立基于口腔微生物组的预后模型。采用随机生存森林（RSF）方法，研究从ASV差异特征中筛选出13个关键微生物标志物，构建13-oral microbiome prognostic model（13-OMP模型）。该模型对6个月结局具有极高的预测能力，AUC达到99.29%，显示出极强的判别效能。研究还考虑了临床指标对预后预测的影响，将临床特征与差异ASVs联合建模，但联合模型的AUC为97.68%，并未超过13-OMP模型。这说明，口腔微生物组本身已包含高度浓缩的预后信息，且其预测性能并不依赖传统临床变量的叠加。该结果提示，口腔微生物组有望成为放疗后早期风险识别的重要工具。
**Predictive functions of the critical oral microbiome correlated with EC progression**
为进一步理解微生物变化可能对应的功能意义，研究通过PICRUSt2及数据库注释进行功能预测。与HCs相比，EC患者口腔微生物组中27个功能模块升高，包括乙醛酸和二羧酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、磷酸戊糖途径；同时22个功能下降，包括硫辛酸代谢、谷胱甘肽代谢和柠檬酸循环。与NRT组相比，RT组中27个功能模块升高，包括氨基糖和核苷酸糖代谢、糖酵解和糖异生、磷酸戊糖途径，而18个功能模块下降，包括核黄素代谢、酪氨酸代谢和不饱和脂肪酸生物合成。MetaCyc分析显示，在PG中有6条通路富集，如糖酵解I、糖酵解II和氨基酸生物合成，而丙酮酸发酵、L-谷氨酸降解和L-赖氨酸发酵等5条通路降低。这些结果表明，食管癌相关的口腔微生态失调不仅体现在菌群组成上，也反映在代谢功能模式重编程上，尤其是与糖代谢相关的途径可能与疾病进展及放疗反应有关。
从讨论部分来看，研究强调了机器学习（ML）与口腔微生物组结合在食管癌精准医学中的应用价值。研究证实，大样本EC患者存在明确的口腔微生物失调，且这种失调可用于构建高准确度的诊断模型和预后模型。研究还指出，放疗后口腔微生态发生显著重塑，机会致病菌减少、部分代谢通路改变，提示口腔微生物组可能与放疗敏感性和疾病恢复过程相关。与此同时，研究亦指出其局限性：样本来自单中心，结果的普适性仍需在其他地区验证；患者随访时间较短，尚需更长时间观察口腔微生物与长期预后的关系；此外，本研究尚未阐明口腔微生物与食管癌之间的因果关系，后续仍需进一步实验验证。
研究结论部分可译为：本研究首次对食管癌患者口腔微生物组进行了横断面与纵向联合分析。研究人员在大样本队列中解析了EC患者口腔微生物组的特征性改变，鉴定出与EC相关的关键菌群，并预测了相关特异性微生物功能。这些结果提示，口腔微生物组失调可能参与EC的发生发展。研究人员构建了两个基于机器学习的EC诊断与预后模型。此外，研究还刻画了EC患者放疗前后的口腔微生物组变化，提示口腔微生物组可能与疾病恢复相关。该研究加深了对口腔微生物组与EC关系的认识，并强调口腔微生物组作为未来EC治疗靶点的潜在价值。
