用于检测三种禽类支原体的快速三靶点金纳米粒子侧向流免疫测定法的研发与验证——禽类支原体免疫层析试纸条检测方法

《BMC Microbiology》：Development and validation of a rapid triple-target gold nanoparticle lateral flow immunoassay for detection of three avian mycoplasmas immunochromatographic strip test for avian mycoplasma detection

　　

摘要

背景

禽类支原体，包括Mycoplasma gallisepticum（MG）、Mycoplasma synoviae（MS）和Mycoplasma meleagridis（MM），是导致家禽呼吸系统及生殖系统疾病的主要病原体，会给养殖业带来巨大经济损失。目前常用的诊断方法如培养法、ELISA和PCR虽然准确可靠，但操作繁琐、成本高昂，不适合在野外进行常规筛查。本研究旨在开发一种快速且经济高效的胶体金免疫层析试纸条，用于同时检测家禽体内针对MG、MS和MM的抗体，从而判断其是否曾暴露于这些病原体或已被感染。

方法

在Escherichia coli中表达重组蛋白pMGA（MG）、VlhA（MS）和Mm19（MM），将其纯化后固定在硝酸纤维素膜上作为检测线。将单克隆抗体和多克隆抗体与20纳米的金纳米粒子结合，并优化反应参数（pH值、抗体浓度、结合比例）。使用一系列特征明确的临床样本评估该胶体金免疫层析试纸条的诊断性能，以ELISA检测作为参考标准。测试样本包括确诊为支原体感染的样本以及其他常见禽类传染性病原体阳性的样本，以此评估诊断的灵敏度、特异性以及潜在的交叉反应性。

结果

所开发的试纸条仅能与MG、MS和MM发生反应，不会与其他禽类支原体种类或常见呼吸道病原体产生交叉反应。其视觉检测限为31.25纳克/毫升，无需任何特殊设备即可15分钟内得出检测结果。与ELISA相比，该试纸条的诊断灵敏度可达96.7%（95%置信区间：82.8–99.9%），特异性为98%（95%置信区间：89.4–99.9%），两者一致性良好（Cohen’s κ值=0.96）。不同检测之间的变异系数低于8%，且在4摄氏度条件下储存至少6个月仍能保持良好的检测性能。

结论

本研究首次提出了一个经过验证的多重血清学检测平台，可同时检测家禽体内针对多种禽类支原体的抗体。所开发的这种三目标免疫层析试纸条是一种快速、准确且经济高效的工具，适用于现场对MG、MS和MM感染进行血清学筛查。由于其操作简单、检测速度快且结果可靠，有望成为家禽健康管理中大规模监测和早期预警工作的理想选择。