从嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中分离的肽类似物诱导白色念珠菌(Candida albicans)多聚集体形成并损害其细胞分裂

《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Peptide Analogs Isolated from Lactobacillus acidophilus Induce Multi-aggregate Formation and Impair Cell Division in Candida albicans

　　

摘要：念珠菌属(Candida spp.)是引起呼吸道、消化道及生殖道感染的常见病原体。Doderlin是从嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中分离得到的抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)，具有非溶血特性，但其序列较长且抗菌谱较宽可能限制其治疗应用。研究人员评估了三种Doderlin类似物(Dod H、Dod B、Dod T)的抗菌活性、细胞毒性及形态功能效应。肽段采用Fmoc固相肽合成法(solid-phase peptide synthesis, SPPS)合成，通过生长实验、流式细胞术(flow cytometry)、荧光显微镜及扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)评价抗菌活性与细胞效应。其中，Dod B对白色念珠菌(Candida albicans)及其他临床相关念珠菌属(包括光滑念珠菌Candida glabrata和热带念珠菌Candida tropicalis)表现出最优的抗真菌活性。值得注意的是，Dod B促进相互连接的细胞多聚集体(multi-aggregate)形成及细胞生理改变，可能与其结合丝氨酰-tRNA合成酶(Seryl-tRNA synthetase, SerRS)和肽基脯氨酰基异构酶(Peptidyl-prolyl isomerase, ESS1)有关。尽管序列优化降低了天然Doderlin的广谱活性，但提高了抗真菌特异性和效力。上述结果表明Dod B是治疗念珠菌感染有潜力的候选药物。

论文解读：从嗜酸乳杆菌中分离的Doderlin类似物Dod B对念珠菌的抗真菌作用及诱导多聚集体形成的机制研究

研究背景与立项依据

念珠菌属(Candida spp.)，尤其是白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)和热带念珠菌(Candida tropicalis)，是引起口腔、生殖道及血流感染的主要病原真菌。随着抗真菌药物的滥用，耐药菌株（如耳念珠菌Candida auris）的出现使临床治疗面临挑战。现有抗真菌药物存在毒性大、对生物膜无效及易破坏正常微生态等局限。抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)因低毒性和可化学合成成为新药研发热点。Doderlin（序列NEPTHLLKAFSKAGFQ，16个氨基酸）源自嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，具广谱抗菌及非溶血性，但较长的序列导致合成成本高，且广谱杀菌可能扰乱正常菌群。因此，研究人员通过截短设计并合成Doderlin的三个八肽类似物——Dod H（N端片段）、Dod B（中间片段，HLLKAFSK）、Dod T（C端片段），旨在降低合成成本、缩小抗菌谱以提高特异性，并探究其抗真菌活性与作用机制。该论文发表于《Probiotics and Antimicrobial Proteins》。

主要关键技术方法

研究人员采用Fmoc固相肽合成法(solid-phase peptide synthesis, SPPS)合成三种Doderlin八肽类似物(Dod H, Dod B, Dod T)并进行RP-HPLC纯化与LC/ESI-MS鉴定；选用革兰阳性菌、革兰阴性菌、数种念珠菌及丝状真菌进行微量稀释法最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)测定与生长曲线分析；以VERO细胞系行结晶紫染色评估细胞毒性；通过膜联蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)双染及DiOC₆(3)、MTT检测白色念珠菌的凋亡/坏死、线粒体膜电位(Δψm)与代谢活性；利用流式细胞术分析细胞周期(DNA含量)与形态学参数(FSC/SSC)；借助Hoechst 33342染色、FITC标记肽段的荧光显微镜及扫描电子显微镜(SEM)观察形态改变与肽内化；采用生物信息学分子对接(molecular docking)预测Dod B与白色念珠菌来源受体[肽基脯氨酰基异构酶ESS1(PDB:1YW5)、丝氨酰-tRNA合成酶Seryl-tRNA synthetase/SerRS(PDB:3QNE)、黏附素Als3(PDB:4LE8)]的结合模式。

研究结果

Synthesis and Purification（合成与纯化）

经RP-HPLC纯化及LC/ESI-MS验证，Dod H、Dod B、Dod T实测质荷比(m/z)分别为951.94、943.87、855.00，与理论值相符，纯度满足后续实验要求，其中Dod B得率最高(51.4 mg)。

Antimicrobial Activity（抗菌活性）

Dod B抗酵母活性最强，对C. albicans、C. tropicalis和C. glabrata的MIC为31.3~62.5 μM，对黑曲霉(Aspergillus niger)MIC为62.5~125 μM，对枯草芽孢敏感菌Microlcocus luteus有抑制但无抗革兰阴性菌活性。与原Doderlin相比，Dod B丧失抗金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌活性，但对念珠菌抑制效力提高，显示抗菌谱变窄、抗真菌特异性增强。

Cytotoxicity Activity（细胞毒性）

Dod H在250~500 μM出现VERO细胞毒性，Dod B在500~1000 μM才出现可见细胞密度下降，Dod T在测试浓度内无毒性。Dod B的细胞毒性浓度远高于其抗真菌MIC（约15倍以上），提示较宽的治疗窗口(therapeutic window)。

Cellular Viability (apoptosis and necrosis)（细胞活力—凋亡与坏死）

经Annexin V/PI双染流式分析，Dod B处理组未见显著Annexin V阳性（无早期凋亡标志磷脂酰丝氨酸外翻），即使1000 μM下坏死(PI阳性)细胞比例也低于15%，表明Dod B不通过膜溶解或典型凋亡/坏死途径杀伤白色念珠菌。

DNA Content and Cell Cycle（DNA含量与细胞周期）

PI染色流式显示Dod B处理组出现前向散射(FSC)增大且PI荧光右移，125 μM起G0/G1样群体减少、S/G2/M样事件增加，250 μM达峰值后回落。此现象部分源于多细胞聚集体被流式视作单事件导致表观DNA含量升高，提示Dod B引起细胞聚集并伴随细胞周期分布改变。

Evaluation of Mitochondrial Potential (?ψm) and Cell Metabolism（线粒体膜电位与细胞代谢）

DiOC₆标记显示从250 μM起线粒体膜电位(Δψm)显著下降；MTT还原法显示125~250 μM代谢活性短暂升高，500~1000 μM回降至对照水平。表明Dod B在低浓度引发代谢应激，高浓度致线粒体功能受损但不引起急性膜破裂。

Morphological Changes（形态学改变）

流式FSC/SSC散点图检测到"多聚集体(multi-aggregate)"亚群（超出常规单细胞检测范围）。荧光显微镜与SEM证实Dod B（≥125 μM）促使白色念珠菌形成由多个细胞紧密连接、共享胞质膜区域甚至胞质沟通的互联性多细胞聚集体，而对照组仅为分散单细胞或≤5细胞小簇，且细胞膜完整无破损。FITC-Dod B显示肽可内化进入酵母细胞。

Molecular Docking（分子对接）

从33个白色念珠菌蛋白中筛选出与多聚集体形成相关的靶点，Dod B可与肽基脯氨酰基异构酶ESS1(1YW5)形成氢键（Dod B Lys⁴–ESS1 Gly⁴⁰），与SerRS(3QNE)形成四个氢键（His¹、Lys⁴、Lys⁸残基分别结合Glu³⁴³、Gly³⁴²、Ser²⁵²），与黏附素Als3(4LE8)形成三个氢键，提示Dod B可能通过干扰ESS1（参与细胞分裂与形态转换）和SerRS（参与翻译与CUG密码子模糊性）功能，阻碍胞质分裂(cytokinesis)从而诱导多聚集体表型。

讨论与结论总结

讨论部分指出：将16肽Doderlin截短为8肽类似物降低了合成成本并缩小了抗菌谱，避免了破坏正常菌群；Dod B选择性抑制致病性念珠菌且对哺乳动物细胞毒性低；其不引起膜破裂或典型凋亡/坏死，而是通过可能的胞内靶标相互作用——干扰ESS1和SerRS功能——阻碍细胞分离，促使白色念珠菌形成互联多聚集体（此表型文献报道与毒力降低相关），同时引起线粒体膜电位下降与代谢改变，最终抑制增殖。分子对接结果支持Dod B与ESS1及SerRS活性位点结合。该研究为开发窄谱、低毒的抗念珠菌AMP类药物提供了实验依据。

结论（翻译）：Dod B肽显示出显著的抗真菌潜力，可抑制白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)及黑曲霉(Aspergillus niger)的生长，且相较于原始肽具有更优效力和更低的最小抑菌浓度(MIC)。此外，其对致病酵母的选择性作用不影响细菌或有益菌群，强化了其作为新型抗真菌候选分子的潜力。值得注意的是，Dod B诱导白色念珠菌形成细胞多聚集体(multi-aggregate)——一种比标准形态毒力更低的表型——并在治疗浓度范围内不改变哺乳动物细胞显著活力，该多聚集体形成可能由Dod B与丝氨酰-tRNA合成酶(SerRS)及肽基脯氨酰基异构酶(ESS1)相互作用所诱导。综上，这些发现突显Dod B是治疗真菌感染特别是多重耐药念珠菌属（如耳念珠菌Candida auris）感染的有前景的候选治疗药物。但仍需体内及临床研究验证其安全性与治疗适用性。