《Veterinary Research Communications》：Immunohistochemical localization of tumor necrosis factor-α in gastrointestinal tissues of budgerigars naturally infected with Macrorhabdus ornithogaster
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鸟胃真菌病是一种传染性真菌性胃肠道疾病，主要影响虎皮鹦鹉（Melopsittacus undulatus）的前胃。尽管鸟胃真菌（M. ornithogaster）感染的病理特征已被广泛描述，但关于自然感染鸟类局部炎症细胞因子反应的信息仍然有限。在本研究中，研究
鸟胃真菌病是一种传染性真菌性胃肠道疾病，主要影响虎皮鹦鹉（Melopsittacus undulatus）的前胃。尽管鸟胃真菌（M. ornithogaster）感染的病理特征已被广泛描述，但关于自然感染鸟类局部炎症细胞因子反应的信息仍然有限。在本研究中，研究人员对来自25只自然感染M. ornithogaster的虎皮鹦鹉和5只未感染对照的存档胃肠道组织进行了组织病理学和免疫组织化学评估。常规组织病理学检查用于表征组织病变，而免疫组织化学则用于评估肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的组织表达。组织学病变主要定位于前胃，包括黏膜糜烂、溃疡、上皮变性以及与大量真菌生物相关的炎症细胞浸润。PAS和Gomori六胺银染色证实了受影响组织内真菌成分的存在和分布。TNF-α免疫反应性主要在病变受影响区域内的上皮细胞和炎症细胞中被检测到，而对照组织则表现出极少或没有免疫染色。这些发现证明了受M. ornithogaster感染的胃肠道组织中TNF-α的局部表达，并支持了与鸟胃真菌病相关的活跃TNF-α炎症反应的存在。本研究为今后评估禽类真菌胃肠道疾病中细胞因子介导机制的定量性和功能性研究提供了描述性基线数据。
鸟胃真菌病（Macrorhabdosis）作为虎皮鹦鹉及其他禽类物种中一种具有重要临床意义的疾病，长期受到兽医病理学界的关注。该疾病由鸟胃真菌（Macrorhabdus ornithogaster，以下简称M. ornithogaster）感染引起，这种真菌属于子囊菌门酵母菌，主要定植于禽类宿主前胃与肌胃之间的峡部。尽管M. ornithogaster感染的病理特征已被广泛描述，但关于自然感染鸟类局部炎症细胞因子反应的信息仍然十分有限，这构成了本研究开展的重要背景。
从研究背景来看，M. ornithogaster感染在鹦鹉目、雀形目和鸡形目鸟类中均有检出，其中虎皮鹦鹉（Melopsittacus undulatus）、小型鹦鹉（Forpus spp.）和金丝雀（Serinus canaria）尤为易感。感染鸟类的临床表现多样，从无症状感染到进行性体重下降、反流、黑便，严重者可致猝死。病理变化主要累及前胃，表现为黏膜糜烂、溃疡和炎症改变，肠管受累则较为罕见。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为关键的前炎性细胞因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，在宿主防御、免疫调节和炎症反应中发挥核心作用。然而，尽管TNF-α在哺乳动物感染性和炎症性疾病中的作用已被广泛研究，但其在禽类真菌感染中的表达和定位数据仍然匮乏。正是基于这一知识空白，研究人员开展了本项研究，旨在描述自然感染M. ornithogaster的虎皮鹦鹉胃肠道组织中TNF-α的免疫组织化学表达情况，并通过记录TNF-α的空间分布与真菌定植及相关病变的关系，为理解禽类鸟胃真菌病中的炎症反应提供描述性证据。该研究发表于《Veterinary Research Communications》。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，利用存档的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织样本建立研究队列，包括25只自然感染M. ornithogaster的虎皮鹦鹉和5只未感染对照；其次，采用常规组织病理学技术（H&E染色）表征组织病变；第三，运用特殊组织化学染色技术，包括过碘酸-希夫（PAS）染色和Gomori六胺银（GMS）染色以确认真菌成分；第四，实施免疫组织化学分析检测TNF-α表达，使用兔多克隆抗TNF-α抗体（1:200稀释），采用热诱导抗原修复和链霉亲和素-生物素过氧化物酶法进行检测；第五，进行计算机序列分析（in silico sequence analysis）以评估抗体交叉反应性，包括从NCBI数据库检索虎皮鹦鹉TNF-α氨基酸序列，与鸡、人、小鼠和大鼠等代表性脊椎物种的TNF-α直系同源序列进行多序列比对、氨基酸同一性分析和系统发育分析。
研究结果部分可按以下小标题进行概述：
大体检查方面，死于鸟胃真菌病的虎皮鹦鹉在剖检时呈现一致的体况和上胃肠道改变。大多数鸟临床状态消瘦，体况差，胸骨龙骨突突出明显。部分鸟出现腹泻，程度从轻度水样粪便到大量绿色粪便不等，偶见未消化食物。上胃肠道的大体病变主要累及前胃，前胃壁增厚并被大量黏稠黏液覆盖，可见多灶性黏膜糜烂和溃疡，偶有点状至弥漫性出血。部分病例肌胃角质层不规则、变色或部分脱落，前胃-肌胃腔内有出血性物质和血凝块。未观察到其他一致的外部大体异常。
细胞学检查方面，前胃印片涂片经Giemsa染色后可见细长杆状生物体，呈蓝紫色丝状结构，单个或成簇存在，高倍镜下显示特征性的横带分段外观。细胞学发现作为组织病理学诊断的支持性依据。
组织学检查方面，最显著的病变定位于前胃，其次为肌胃。M. ornithogaster生物体主要见于前胃黏膜腔面和上皮隐窝内，部分病例深入腺体结构。生物体数量和密度在不同个体间存在差异。生物体数量较多区域的黏膜常出现糜烂或溃疡性改变，包括上皮不连续、黏膜变薄和固有层局灶性暴露。炎症改变程度不一，以淋巴细胞、浆细胞和异嗜性粒细胞浸润为特征，浸润范围从多灶性至弥漫性不等，位于固有层和黏膜下层。前胃的病理学改变最为一致，而肌胃和肠段病变较少见。
组织化学染色方面，PAS染色显示生物体呈红至紫红色细长结构，位于黏膜表面和上皮隐窝内，为长而细的杆状或丝状结构，染色强度相对均匀。GMS染色则将生物体显示为黑色细长杆状，与周围组织形成清晰对比，便于在不同程度的黏膜改变区域中进行定位。
免疫组织化学分析方面，感染M. ornithogaster的虎皮鹦鹉胃肠道组织中检测到TNF-α免疫反应性。在对照组织及未观察到真菌生物体的切片中，TNF-α染色缺失或仅局限于弱的弥漫性胞质标记。在含M. ornithogaster的组织中，TNF-α阳性反应见于多种细胞群，包括衬覆黏膜表面和腺组织结构的上皮细胞，以及固有层内的细胞。在表现黏膜糜烂或溃疡的区域，TNF-α免疫反应性还见于浸润的炎症细胞，包括巨噬细胞样和淋巴细胞样细胞。TNF-α阳性细胞主要定位于表现组织学改变的区域，而相邻无检出生物体的区域则显示极少或没有染色。阴性对照切片未显示特异性免疫反应性。
讨论部分，研究人员首先指出鸟胃真菌病仍是虎皮鹦鹉及其他禽类中重要的临床疾病，常与慢性胃肠道病理和不良临床结局相关。研究结果与既往报道一致：临床和大体上，感染鸟表现为消瘦,前胃为主的胃肠道病变，包括黏膜增厚、溃疡、出血和过量黏液产生，支持胃环境破坏是促进真菌 tissue damage factors fungal colonization 的关键因素。组织病理学上，病变主要定位于前胃，未发现肿瘤性病变，这与M. ornithogaster感染相关前胃腺癌的孤立报告形成对比，提示疾病表现的异质性可能与宿主因素、感染时长或菌株变异性有关。
通过H&E、PAS和Gomori六胺银染色支持的M. ornithogaster鉴定与既往研究一致，但本研究未对真菌负荷进行定量，也未与病变严重程度进行统计学相关性分析。免疫组织化学分析显示，感染组织中上皮细胞和炎症细胞存在TNF-α免疫反应性，而对照组织则极少或没有染色。虽然在哺乳动物中TNF-α是关键的炎症介质，但其在禽类真菌感染中的作用仍远未充分阐明。本研究发现M. ornithogaster定植的炎症胃肠道组织内存在空间定位的TNF-α免疫反应性，支持了与感染相关的活跃黏膜炎症反应的存在。
研究人员也坦诚了本研究的局限性：研究依赖自然感染鸟的存档样本，导致疾病阶段和组织可用性存在变异；未进行M. ornithogaster的分子确认；免疫组织化学发现未得到定量细胞因子分析或统计学评估的支持；缺乏定量免疫组织化学评分或分子细胞因子谱分析；仅评估了TNF-α而未涉及其他可能参与疾病发病的炎症介质。
研究结论部分翻译如下：本研究证明了自然感染鸟胃真菌（M. ornithogaster）的虎皮鹦鹉胃肠道组织中存在TNF-α免疫反应性的局部化，特别是在表现上皮损伤和炎症细胞浸润的区域。这些发现支持了与鸟胃真菌病相关的活跃局部炎症反应的存在，并为伴随感染的病理改变提供了额外认识。尽管本研究的描述性质排除了关于机制通路或因果关系的结论，但观察到的TNF-α表达凸显了前炎性细胞因子信号在宿主对M. ornithogaster反应中的潜在参与。进一步的研究有必要整合定量免疫学和分子学方法，以阐明细胞因子在禽类鸟胃真菌病疾病进展和组织损伤中的功能作用。
