卷烟烟雾提取物（Cigarette Smoke Extract, CSE）降低气液界面（Air-Liquid Interface, ALI）体外分化的人原代支气管上皮细胞（primary human bronchial epithelial cells, pHBECs）中功能性瞬时受体电位香草素亚型4（TRPV4）通道的表达

《Archives of Toxicology》：Cigarette smoke extract (CSE) reduces expression of functional TRPV4 channels in primary human bronchial epithelial cells differentiated at an air liquid interface (ALI) in vitro

　　

摘要：吸烟者的气道人原代支气管上皮细胞（primary human bronchial epithelial cells, pHBECs）长期暴露于卷烟烟雾（cigarette smoke, CS），可能诱发全球死因第四位的慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）。研究人员利用已建立的pHBECs在气液界面（air-liquid interface, ALI）分化为假复层上皮的方案，分析了施加卷烟烟雾提取物（cigarette smoke extract, CSE）——其上调了7个烟雾暴露调控基因（smoke exposure regulated genes, SERGs）——后瞬时受体电位香草素亚型4（transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4）蛋白的功能性表达。与未处理对照组相比，慢性暴露于CSE 28 d后，质膜上的TRPV4蛋白表达及纤毛细胞纤毛旁的TRPV4定位均减少，而细胞屏障功能未发生改变。相应的，CSE暴露后pHBECs中TRPV4介导的Ca2+内流被阻断。此外，可与TRPV4结合并保护其免于被多聚泛素化（polyubiquitination）降解的Os-9蛋白，在CSE暴露的pHBECs中表达显著降低。最值得注意的是，在pHBECs中过表达OS-9可挽救CSE诱导的TRPV4蛋白水平下调。本研究揭示了CSE通过干扰pHBECs中TRPV4和OS-9表达发挥毒性的新型分子机制，可能为COPD的新治疗策略开辟道路。

论文解读：卷烟烟雾提取物通过下调OS-9促进TRPV4多聚泛素化降解损害人支气管上皮细胞功能

研究背景与目的

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是全球致死率居第四位的疾病，吸烟是其最主要诱因。人原代支气管上皮细胞（primary human bronchial epithelial cells, pHBECs）是卷烟烟雾（cigarette smoke, CS）的首个靶细胞，其纤毛细胞介导的黏液纤毛清除（mucociliary clearance, MCC）功能受损是COPD早期特征。瞬时受体电位香草素亚型4（transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4）通道在气道上皮参与调控钙离子（Ca²⁺）信号及纤毛发生，但其是否在CS致支气管上皮毒性中受调控及具体机制尚不清楚。已有研究提示OS-9（also known as TMED9）可结合TRPV4单体阻止内质网相关降解（ER-associated degradation, ERAD）中的多聚泛素化。本文旨在探究卷烟烟雾提取物（cigarette smoke extract, CSE）对ALI分化pHBECs中TRPV4通道表达、功能及OS-9/TRPV4互作的影响，阐明CSE损伤气道上皮的新型分子机制。该论文发表于《Archives of Toxicology》。

主要关键技术方法

研究人员获取健康非吸烟供者原代人支气管上皮细胞（pHBECs, Lonza CC#2540S），经扩增后接种于IV型胶原包被的Transwell插入件，气液界面（air-liquid interface, ALI）诱导分化28 d，基侧施加5% CSE模拟慢性烟雾暴露。通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）法测细胞毒性；FITC-葡聚糖渗透实验评估上皮屏障完整性；免疫荧光（immunofluorescence, IF）与激光共聚焦显微镜观察细胞分型（乙酰化微管蛋白标记纤毛细胞、CC10标记Clara细胞、MUC5AC标记杯状细胞）及TRPV4亚细胞定位；Western Blot检测TRPV4、OS-9蛋白量；实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）检测mRNA；Fura-2 AM负载钙成像测定TRPV4激活剂GSK1016790A诱导的胞内Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]_i）变化；邻近连接 assay（proximity ligation assay, PLA）检测TRPV4-OS-9相互作用；泛素富集试剂盒纯化多聚泛素化TRPV4；脂质体3000于分化第4周转染OS-9-eGFP质粒进行挽救实验。

研究结果

Experimental setup of a human air liquid interface (ALI) for detection of acute and chronic airway toxicity by cigarette smoke extract (CSE)

研究人员建立ALI模型，筛选确定5% CSE为无急性细胞毒性的慢性暴露浓度，该浓度可成功上调7个吸烟者支气管中差异表达的烟雾暴露调控基因（smoke exposure regulated genes, SERGs），模拟体内慢性吸烟的基因应答特征。

Chronic application of CSE reduced number of ciliated cells and TRPV4 channels in an ALI model of the bronchial epithelium

慢性CSE暴露28 d后，纤毛细胞数量及纤毛标志物乙酰化微管蛋白（acetyl-α-tubulin）表达显著减少，杯状细胞和Clara细胞亦减少，但总细胞数（DAPI计数）及跨上皮电阻（TEER）/荧光素葡聚糖通透性未见显著差异，提示分化阻滞而非细胞死亡。Western Blot显示TRPV4蛋白量随分化时间显著低于对照组，而TRPV4 mRNA反而上调；免疫荧光显示对照组TRPV4定位于纤毛基部纤毛细胞顶膜，CSE组该定位消失；钙成像显示CSE组经TRPV4特异性激动剂GSK1016790A刺激后无明显[Ca²⁺]_i升高，证实功能性TRPV4通道丢失，且为转录后水平调控。

OS-9 expression and its interaction with TRPV4 channels is reduced after CSE exposure

Western Blot及PLA结果显示，CSE暴露后OS-9蛋白表达显著下调，且TRPV4与OS-9的物理相互作用信号（PLA荧光点）较对照组明显减少，提示CSE破坏了OS-9对TRPV4的稳定结合。

CSE-induced polyubiquitination of TRPV4 is reduced after over-expression of OS-9 in airway epithelial cells

泛素富集Pull-down显示CSE组多聚泛素化TRPV4水平较对照组升高。在CSE暴露同时转染OS-9过表达质粒可显著提升胞内OS-9及TRPV4总蛋白量，并使多聚泛素化TRPV4水平回落。证明CSE通过下调OS-9解除其对TRPV4的多聚泛素化保护，导致TRPV4被ERAD途径降解。

讨论与结论

研究人员讨论指出，5% CSE经基侧施加可模拟慢性吸烟者气道上皮基因改变，引起ALI分化模型中纤毛细胞分化受阻但未破坏紧密连接屏障，这与体内吸烟者上皮黏液纤毛清除下降但基底膜相对完整的早期表型一致。TRPV4蛋白（非mRNA）丢失与其纤毛旁定位消失及Ca²⁺响应丧失相符，且与该课题组先前发现的TRPV4敲低致纤毛细胞减少相互印证，支持TRPV4参与纤毛发生/维持。机制上，CSE下调OS-9使TRPV4未被OS-9结合而易被多聚泛素化并经蛋白酶体降解，过表达OS-9可挽救TRPV4水平并减少泛素化TRPV4，明确了OS-9是CSE-TRPV4轴的关键节点。

结论翻译（浓缩自Discussion末段）：本研究证明CSE暴露通过下调OS-9表达削弱OS-9与TRPV4的相互作用，致使TRPV4发生多聚泛素化降解，进而引起人支气管上皮细胞功能性TRPV4通道减少及纤毛细胞分化受损。TRPV4及其互作伴侣OS-9有望成为减轻卷烟烟雾对气道上皮毒性、改善COPD黏液纤毛清除障碍的潜在治疗靶点。