胶原及胶原-纤连蛋白网络的结构架构与肝癌细胞侵袭行为相关

《Cellular Oncology》：Structural architecture of collagen and collagen-fibronectin networks is associated with the invasive behavior of liver cancer cells

　　

细胞外基质（ECM）重塑是肝脏肿瘤发展的关键特征，尤其在肝细胞癌（HCC）和肝内胆管癌（iCCA）中。纤维化（Fibrosis）和肝硬化（Cirrhosis）是肿瘤发生的危险因素，并导致细胞外基质发生显著的结构改变。纤维化诱导的胶原和纤连蛋白（Fibronectin）改变了细胞外基质的硬度（Stiffness）和异质性（Heterogeneity）。硬化且异质的细胞外基质促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。细胞外基质结构变化对HCC/iCCA癌细胞的直接效应研究尚不充分。研究方法为将HCC和iCCA细胞与不同结构的胶原及胶原-纤连蛋白网络进行接触培养。网络的结构架构通过将归一化硬度、孔径和网络分布值整合为细胞外基质架构指数（ECM Architectural Index, EAI）来定义。研究确定了细胞-基质相互作用对细胞硬度、侵袭性以及通过网络纤维位移与网络架构相互作用能力的影响。结果表明，EAI升高导致细胞硬度降低、细胞侵袭性增加以及纤维位移改变。根据不同EAI条件，HCC和iCCA细胞表现出不同的效应。高EAI导致跨癌细胞类型的低细胞硬度和高细胞侵袭性。结论：研究人员提出了一个适用的模型系统，用于识别细胞外基质对癌细胞的结构诱导影响，并探究肿瘤环境结构变化的风险因素。

原发性肝癌包括肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）和肝内胆管癌（Intrahepatic Cholangiocarcinoma, iCCA），是全球发病率上升且预后不良的恶性肿瘤。此类癌症的预后 strongly 取决于肿瘤细胞的肝脏组织侵袭能力及转移的发生。肝脏组织的结构与功能完整性依赖于基质组（Matrisome），即一种复杂而动态的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）。细胞外基质由超过300种大分子组成，可分为蛋白聚糖（Polyglycans）、糖蛋白和胶原。在健康组织中，动态的细胞外基质支持生理功能并限制肿瘤发生；而在肝脏疾病进展过程中，慢性损伤触发伤口愈合反应，活化的肝星状细胞转分化为肌成纤维细胞，增加胶原和纤连蛋白的分泌，导致细胞外基质重塑。由此，纤连蛋白及多种基底膜胶原（如I型、III型、IV型和VI型）不同程度升高，其中I型胶原与肝硬化进展最为相关。

细胞外基质重塑可通过多种机制显著促进肿瘤启动和进展。肿瘤发展可由机械应力联合炎症诱导的纤维化及纤维化诱导的炎症所触发，这些因素在慢性炎症-纤维化循环中相互作用，促进基因组不稳定性并损害DNA修复。机械应力通过多种途径转化为生化信号，包括整合素（Integrin）介导的机械转导（Mechanotransduction）、通过Rho/ROCK信号通路增加细胞内部收缩性、通过转录共激活因子YAP和TAZ的Hippo信号通路、纤维化驱动的炎症，以及促进促有丝分裂信号的TGF-β和HGF等生长因子。在HCC中，重塑的纤维性细胞外基质成分形成纤维包膜，破坏血管化，导致正常肝窦丧失，并增加结构异质性。纤连蛋白作为肝组织细胞外基质中的糖蛋白，在慢性损伤期间强烈积累，同样与HCC发展相关。一旦肿瘤形成，细胞外基质密度增加和排列有序可促进肿瘤进展。尤其值得注意的是，细胞外基质的功能性紊乱——即结构、机械、生化和反馈介导的动态紊乱的相互作用——导致癌细胞对机械应力的敏感性增加，而刚性胶原纤维可作为癌细胞迁移的物理轨道。尽管这些机制被认为促进肿瘤发展和进展，但肝硬化、基质组异常与肝癌之间的复杂关系仍不完全清楚。

测量肝脏硬度已成为肝脏疾病分期和患者预后评估的标准临床程序。此外，肝脏硬度增加与发展原发性肝癌的更高风险以及肝肿瘤转移/侵袭率更高相关。胶原作为细胞外基质的核心成分，日益被视为实验性治疗的高价值靶标。鉴于机械刚性、结构重塑与肝癌进展中胶原和纤连蛋白存在的紧密关联，该研究探讨了胶原和纤连蛋白为基础的细胞外基质结构的异质性如何影响细胞-基质相互作用，具体探索这些机械变异如何影响肿瘤细胞侵袭并驱动单个细胞硬度的显著改变。

研究人员建立了基于I型胶原的网络体系，包括含与不含纤连蛋白的条件，并对其进行了生物物理学特性检测。该研究将归一化硬度、孔径和网络分布值整合形成ECM架构指数（EAI），构建了由KKU-213、Huh7和HepG2细胞组成的HCC和iCCA肝癌细胞模型系统，使其与各种网络接触，从细胞硬度、癌细胞侵袭性及纤维位移等角度考察细胞-基质相互作用。研究发现，中等和高EIA可降低细胞硬度、增加癌细胞侵袭性，从而促进癌细胞侵袭性增强。

在生物物理学特性分化方面，"低"EAI胶原网络视觉上呈现均匀分布的细小纤维结构，添加纤连蛋白后结构稍松散；"中等"EAI网络由长而细的纤维和大的结节状结构组成，纤连蛋白添加使纤维变粗、结节结构变粗糙；"高"EAI网络与低、中等网络相比结构分布更不规则，短而细的纤维结构和更粗厚的纤维状胶原构造共同形成强烈的结节状结构。ECM架构指数（EAI）的定义整合了归一化硬度、孔径和网络结构空间分布（即不均匀性）的欧几里得范数，实现了对ECM架构的描述和低、中、高三类分类。结果显示，"中等"和"高"网络的硬度显著高于"低"网络；纤连蛋白添加显著提高了网络硬度，但"高"EAI条件下含纤连蛋白网络的硬度显著低于纯胶原网络。纯胶原网络的孔径从"低"到"中等"到"高"显著增大，而胶原-纤连蛋白网络的孔径从"低"到"中等"显著增大、从"中等"到"高"显著减小。纯胶原网络的不均匀性从"低"到"中等"到"高"显著递增；胶原-纤连蛋白网络中，"中等"和"高"网络的不均匀性显著高于"低"网络，且"中等"网络的不均匀性显著高于纯胶原网络。

在细胞硬度测定方面，通过原子力显微镜（Atomic Force Microscope, AFM）以杨氏模量（Young's Modulus）表达的KKU-213细胞在纯胶原"低"EAI网络上的硬度显著高于"中等"和"高"EAI网络；Huh7细胞在"低"EAI纯胶原网络上的硬度显著高于"高"EAI网络。在纯胶原网络中，Huh7和KKU-213细胞的硬度显著高于HepG2细胞。在含纤连蛋白的胶原基质中，KKU-213细胞在"低"网络上的硬度高于"中等"网络且显著高于"高"网络；Huh7细胞在"高"网络上的硬度显著低于"低"和"中等"网络。HepG2细胞在含纤连蛋白的胶原网络中，"中等"网络条件下硬度较高而"高"网络条件下较低。研究还发现，在"中等"EAI模型系统中，所有细胞系在基质结合纤连蛋白影响下表现出更高的细胞硬度；而在"高"EAI条件下，此效应趋向反转。总体而言，KKU-213和Huh7细胞在"低"网络上的硬度显著高于"高"网络，而HepG2细胞硬度受网络EAI影响较小。在含或不含纤连蛋白的"高"EAI网络中，所有检测细胞系的细胞硬度均处于相似的低水平。

在肝癌细胞侵袭研究方面，"低"EAI模型系统中，KKU-213、Huh7和HepG2细胞主要表现为弱侵袭性，侵袭深度较低。与"低"网络相比，"中等"网络显著促进KKU-213细胞的侵袭（与纤连蛋白添加无关），而HepG2细胞的侵袭不受"中等"胶原网络影响。对于Huh7细胞，"中等"网络中纤连蛋白的添加显著促进其侵袭，提示一定的纤连蛋白依赖性促侵袭效应。在"高"EAI网络中，所有检测细胞系的侵袭性和侵袭深度均显著高于"低"和"中等"网络，强调了结构架构对侵袭行为的影响及由此导致的细胞侵袭性增强。Huh7细胞在"中等"和"高"条件下含纤连蛋白的网络中比纯胶原网络更具侵袭性；而KKU-213和HepG2细胞中未观察到纤连蛋白对胶原网络侵袭的显著影响。

在细胞-基质相互作用及纤维位移方面，"低"EAI纯胶原网络中，KKU-213细胞的纤维位移相对较高，HepG2和Huh7细胞较低；"中等"纯胶原网络中，HepG2和Huh7细胞的纤维位移高于"低"网络，而KKU-213细胞保持相似范围；"高"纯胶原网络中，KKU-213细胞的位移显著更高，而HepG2和Huh7细胞保持在"中等"水平。在胶原-纤连蛋白网络中，各细胞系的纤维位移模式有所不同。KKU-213细胞在"低"和"高"EAI网络中，纯胶原网络的纤维位移显著高于胶原-纤连蛋白网络，提示纤连蛋白限制了其纤维位移。HepG2细胞在所有EAI网络中，纤连蛋白的存在均显著限制了纤维位移。Huh7细胞在"低"EAI网络中胶原与胶原-纤连蛋白网络间存在显著差异，但在"中等"和"高"EAI网络中两种基质条件下的纤维位移水平相同。

在讨论部分，研究人员指出基质组改变在肿瘤发生和肿瘤侵袭中起关键作用，由免疫反应、基因突变以及细胞外基质结构和组成变化等多重机制驱动。胶原作为基质组的结构 backbone，提供 tensile strength、稳定性并组织支持其他细胞外基质成分。该研究建立了可调的结构架构不同的胶原基细胞外基质模型系统，模拟不同程度的细胞外重塑肝脏组织，并鉴定了 cell matrix 结构架构、细胞硬度与肝癌细胞侵袭行为之间的直接 correlation。通过比较纯胶原和胶原-纤连蛋白基细胞外基质模型系统，研究检测到所考察细胞-基质相互作用谱中的细胞系特异性依赖关系。

研究人员使用不同I型胶原网络（含与不含纤连蛋白）模拟肝脏疾病进展过程中的细胞外基质。纤维化和肝硬化作为驱动肝脏疾病进展的因素，细胞外基质因重塑过程而改变，包括硬度、孔径、分布和网络成分组成的变化。值得注意的是，细胞外基质成分具有双重作用：富含胶原的高度无序基质形成物理屏障， trapping 自然杀伤细胞并抑制免疫监视；而均质的细胞外基质架构减少癌症干细胞富集和药物抵抗。这些发现提示靶向肝脏细胞外基质结构可能通过与免疫治疗协同，通过正常化基质硬度和破坏免疫抑制性微环境来发挥作用。

该研究的模型系统试图通过整合硬度和内在因素来描述网络特性，这些特性被整合为单一指数（EAI），以量化网络差异。网络特性，特别是硬度，并非随EAI升高而线性增加；整体结构特性，尤其是网络成分的分布，起着决定性作用。研究中还考虑了网络中大结节状结构对细胞的影响，如"高"EAI网络中的结节状结构源于不同提取胶原的聚合方式。牛胶原经胃蛋白酶处理后端肽位点受限，影响胶原成分在重组为网络结构过程中的组装。纤连蛋白的添加改变了重组胶原纤维的交联行为，导致纤维排列和相关硬化，以及内在特性的改变。在"高"EAI和纤连蛋白条件下，与纯胶原"高"EAI网络相比硬度较低，这归因于网络成分的结构分布改变，表现为较小的孔径和更广泛的不均匀性分布。

不同细胞或细胞系根据其粘附的底物具有不同的细胞硬度，因为细胞硬度受环境调节。基于AFM的硬度测量可区分正常细胞和癌细胞，或区分不同侵袭程度的癌细胞系。研究通过测量粘附于较大细胞簇的细胞来最小化软底物上细胞被压入基质的影响，并将所得细胞系特异性硬度与相应网络关联。细胞特性受细胞外基质模型系统各自的生物物理学特性和结构影响，从而对细胞侵袭性和细胞硬度产生影响。特别值得注意的是，KKU-213和Huh7细胞表现出与基质硬度相反的细胞硬度发育模式：两种细胞系在与低EAI低硬度基质接触时表现出高细胞硬度，而在与较硬的"中等"和"高"EAI胶原网络接触时表现出较低的细胞硬度。HepG2细胞则呈现完全不同的模式，其细胞硬度随基质硬度增加而增加，这与许多现有研究和预期趋势一致。然而，当考察两种中间状态（胶原±纤连蛋白）时，两种状态下基质硬度存在显著差异，但与较软基质（不含纤连蛋白）相比，细胞在与较硬网络（含纤连蛋白）接触时硬度更高，这再次强调了考察细胞外基质模型系统架构特性（硬度加内在特性）的重要性。

细胞硬度降低对不同网络侵袭的影响具有细胞系特异性。对于KKU-213细胞，结构变化具有直接效应，在所有条件下降低的细胞硬度与高侵袭性相关，这种相关性在Huh7细胞中较弱。HepG2细胞对不同网络条件下细胞硬度变化较不敏感。值得注意的是，即使在"低"EAI网络中，HepG2细胞也表现出比KKU-213和Huh7细胞更低的细胞硬度。所有检测细胞系在与"高"EAI网络接触时均表现出低细胞硬度，在这种条件下所有研究细胞系均高度侵袭。与网络结构相比，胶原来源似乎对侵袭性增加没有影响，这表明显著改变的结构特性相互作用（如高EAI所示）导致细胞硬度降低，从而使细胞硬度表达在"促侵袭"水平。高EAI和促迁移细胞硬度导致高度侵袭的 inter-cooperative 行为。尽管该研究考察的是单细胞迁移，但可以与肿瘤内癌细胞行为进行类比。

肿瘤细胞侵袭行为反映其恶性程度和侵袭性。所有研究癌细胞系在"高"EAI模型系统中侵袭性增加，这与细胞特性和网络特性的组合相关。所有观察细胞系在与"高"EAI网络接触时，细胞硬度处于促进细胞-基质相互作用的 regime，这是由于细胞flexibility增加所致。结构上，"高"EAI网络（含与不含纤连蛋白）中分布有结节状结构，其中形成排列有序的胶原结构，使细胞能够比其他网络条件下迁移得更远、数量更多。这种癌细胞沿排列有序的ECM纤维优先迁移的效应已在其他研究中观察到，纤维排列也见于体内侵袭性肿瘤附近和体外癌症类器官中，指示细胞外基质重塑诱导的侵袭性肿瘤行为。

某些癌细胞系显然比其他细胞系具有更高的侵袭潜力。对于此类高度侵袭性癌细胞，即使细胞外基质结构的微小变化也足以释放其迁移和侵袭增加的潜力。细胞硬度与环境的结构影响相结合，可影响细胞侵袭相应网络的能力。对于高度侵袭性的iCCA细胞（KKU-213），其对网络特性单独变化的反应比其他研究细胞更为 aggressive。与HepG2和Huh7细胞仅在"高"EAI网络中表现出高侵袭性不同，KKU-213细胞对"中等"EAI网络的结构架构也表现出侵袭性增加的反应。应用于本研究所用不同细胞系代表的各种原发性肝脏肿瘤的疾病发展，这一观察得到iCCA沿胆管或静脉分支侵袭性生长特征的支持。HCC细胞系Huh7在硬化和孔径增加及不均匀性增加的"中等"网络（含纤连蛋白）影响下变得更具侵袭性。与之相比，HepG2细胞仅在与"高"EAI模型系统接触时高度侵袭。

在基质中迁移的细胞与网络结构保持 constant 接触。通过整合素结合，细胞连接到细胞外基质，这使细胞能够通过机械转导进一步向纤维网络迁移。基于机械转导的细胞-基质相互作用主要是拉动或推动纤维。细胞反映其周围基质的特性，根据细胞外基质模型系统的特性和所使用细胞系的特定能力，观察到的纤维位移有所不同。由于这些细胞-基质相互作用仅能归属于侵袭性细胞群体的特定 subset，它们揭示了特定细胞亚群与其细胞外环境的相互作用，通过描述力生成和运动能力来反映细胞与所使用网络结构的相互作用能力。在这一背景下，纤维位移分析结果表明，改变的细胞外基质结构架构可以促进细胞-基质相互作用。

机械信号向生化信号的转化是细胞-基质相互作用的基础。通过粘附性（如整合素）或非粘附性（如Piezo1）力传感器在细胞和细胞外基质之间发生的通信，是理解细胞在不同结构细胞外基质条件下恶性行为的关键。机械传感器如何对结构架构变化与基质硬度变化做出不同反应的问题需要进一步研究。在此背景下，机械敏感细胞核也暴露于机械转导因子传递的变化，RhoA/ROCK和YAP/TAZ等信号通路在机械调节中发挥关键作用。细胞硬度、核变形和侵袭性形成重要的机械生物学轴，核形状变化提示外部影响由细胞外基质结构架构的差异所介导。

研究中使用、在胶原混合物纤维化前添加的纤连蛋白，在硬度、孔径和网络不均匀性方面影响了网络结构。此外，基质结合的纤连蛋白具有几个显著但细胞特异性的效应。特别值得注意的是，在纤连蛋白存在的情况下，HCC细胞Huh7在EAI增加的网络中侵袭性增强，而KKU-213和HepG2细胞未观察到这种效应。相反，KKU-213细胞（在"高"EAI网络中）和HepG2细胞（在所有网络条件下）在含纤连蛋白网络中表现出对细胞-基质相互作用的抑制效应。纤连蛋白改变了网络的结构架构并在特定条件下影响了细胞-基质相互作用。由于该研究主要调查结构贡献及其对细胞-基质相互作用的影响，而非纤连蛋白的纯细胞生物学影响，这一重要联系需要在后续研究中更深入地探讨。"中等"和"高"EAI状态的胶原-纤连蛋白网络之间存在多方面的权衡，其中侵袭性增加与硬度的关联不如与结构架构中硬度与内在特性的相互作用密切。

在癌症发展和恶性肿瘤存在期间，细胞外基质经历持续的重塑过程，导致肿瘤周围组织更加异质，并作为创建免疫和治疗屏障的因素，促进肿瘤微环境形成。从"高"到"低"EAI的方向，该体外模型系统证明EAI降低（网络软化和更均质的结构分布）对细胞具有降低侵袭性的效应。与此解释一致的是日益讨论的联合特定肿瘤治疗来改变细胞外基质的治疗方法，包括靶向纤维化发展中激活的生长因子或信号通路的抗纤维化药物、基质软化联合细胞内机械信号转导阻断、间充质干细胞治疗逆转肝纤维化、或抑制胶原生物合成和过表达基质金属蛋白酶等，这些均是有前景的治疗策略。

该研究结论指出：研究展示了细胞外基质结构变化如何影响生物物理学特性并增强侵袭性肝癌细胞侵袭。各种细胞外基质模型系统及其对癌细胞 respective 效应，说明了网络异质性的显著和渐进性变化如何影响癌细胞侵袭。该研究综合了细胞外基质结构架构驱动肝癌侵袭和细胞-基质相互作用的机制性见解，强调了细胞外基质结构架构用于个体化风险预测癌症侵袭和转移的潜力，以及治疗干预的可能性。