《Journal of Gastroenterology》：Emerging omics diagnosis of perihilar cholangiocarcinoma
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肝门部胆管癌（perihilar cholangiocarcinoma，pCCA）常表现为性质未定的肝门部胆道狭窄。由于传统胆道腔内取样及血液学标志物的敏感性有限，尤其是在合并原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis，P
肝门部胆管癌（perihilar cholangiocarcinoma，pCCA）常表现为性质未定的肝门部胆道狭窄。由于传统胆道腔内取样及血液学标志物的敏感性有限，尤其是在合并原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）等额外混杂因素的患者中，其诊断常发生延迟或存在不确定性。这种诊断模糊性可显著影响临床结局，因为及时检出与准确分型对于转诊及实施根治性治疗意图的干预至关重要。因此，推进诊断方法学的研究已成为优先方向。pCCA具有独特的蛋白质组学特征、被激活的信号级联模式、表观遗传修饰以及其解剖生态位中的代谢相互作用。近年来，基于组学的诊断进展已利用这些生物学特征来鉴定可用于准确诊断pCCA的生物标志物。本综述总结了利用临床可及样本开展pCCA组学诊断的新兴证据，相关样本包括胆道刷检标本、胆汁以及血清/血浆样本。文章讨论了构成新型技术开发基础的pCCA关键生物学特征，涵盖糖基化/磷酸化/蛋白质组学、基因组学、甲基组学、代谢组学和脂质组学分析以及多组学整合方法。最后指出，人工智能（artificial intelligence，AI）有望帮助将上述数据整合进入诊断算法，同时明确了推动这些诊断策略进入常规临床实践仍需进一步研究的关键领域。
Introduction
文章首先界定了胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）的疾病谱，并指出肝门部胆管癌（perihilar cholangiocarcinoma，pCCA）是其最常见的解剖亚型之一，约占全部CCA的50%–60%。尽管pCCA总体属相对少见肿瘤，但其死亡负担显著偏高，原因在于多数患者就诊时已属进展期，且有效的全身治疗手段有限。pCCA起源于左右肝管与肝总管汇合区域，宏观上多呈导管周围浸润型，组织学上以产黏液腺癌为主，并具有显著的硬纤维性间质反应。临床上常表现为肝门部狭窄、梗阻性黄疸与胆汁淤积，而原发性硬化性胆管炎（PSC）、IgG4相关疾病、胆囊癌及肝转移瘤等良恶性病变均可造成鉴别诊断困难。因此，如何高效、准确地区分pCCA与其他肝门部狭窄性病变，是实现根治性治疗的关键前提。
作者进一步指出，当前标准诊断路径主要依赖横断面影像学检查，如磁共振成像/磁共振胰胆管成像（MRI/MRCP），并结合胆道腔内取样。然而，常规刷检细胞学及荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）虽具有较高特异性，但对pCCA的敏感性有限，在PSC及良性狭窄背景下表现更差。糖类抗原19-9（CA19-9）虽是最常用的血液标志物，但其诊断效能易受良性胆道炎症、胆汁淤积及Lewis抗原阴性状态影响。基于此，文章提出理想的诊断补充工具应能够利用微创、临床可及的样本，捕捉早期肿瘤分子信号。所谓“组学”方法，即基因组学、甲基组学、糖基化/磷酸化/蛋白质组学、代谢组学及脂质组学，正是通过解析不同层级的肿瘤生物学特征，提供相互正交的分子证据，从而提高诊断确定性并缩短诊断时间。
Current molecular testing landscape
在当前分子检测格局部分，作者概述了AASLD与EASL指南对pCCA诊断的基本要求，即治疗前应尽可能获得组织学或细胞学证实。现行指南推荐的核心方法包括刷检细胞学、FISH及血清CA19-9，但三者均存在明显局限。刷检细胞学在临床中应用广泛，特异性可达约97%，但敏感性仅约43%–45%。其低敏感性的根本原因，与pCCA明显的硬纤维性间质、上皮下浸润生长模式以及肿瘤细胞向胆管腔内脱落不足密切相关，而炎症及既往支架置入也会进一步降低取样质量。
FISH作为刷检细胞学的辅助方法，可通过荧光探针检测胆道刷检标本中的染色体异常。其验证队列中敏感性和特异性分别约为64.7%和92.9%，但真实世界表现具有较强情境依赖性：肝门部狭窄更易出现假阴性，而PSC虽然可能降低假阴性，却也可能削弱特异性。CA19-9则仍是当前最常用的血液生物标志物，汇总分析显示其敏感性约72%、特异性约84%，但在胆道梗阻、胆管炎及其他炎症性胆道疾病中常出现假阳性，且约7%–10%个体由于缺乏Lewis抗原而不分泌该标志物。因此，现有诊断体系虽构成临床实践基础，但仍难以可靠解决pCCA最核心的问题，即在微创条件下准确区分恶性与良性炎症性/梗阻性狭窄，尤其是在PSC相关疾病场景中。
Emerging diagnostic approaches
在新兴诊断策略总论中，作者强调pCCA具有独特的蛋白质组、信号转导、表观遗传及代谢重编程特征，这些特征共同构成了组学诊断开发的生物学基础。相较传统检测高度依赖肿瘤细胞丰度，组学技术可在胆汁、血清、血浆及胆道刷检等临床易获取样本中，检测来源于肿瘤本体及其微环境的分子改变，因此尤其适合pCCA这类肿瘤细胞含量低、间质成分丰富且受炎症干扰显著的疾病场景。文章随后从蛋白质组学、基因组学、甲基组学、代谢组学、脂质组学到多组学整合，逐层梳理了当前证据。
Proteomics, phosphoproteomics and glycoproteomics
在蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学与糖蛋白质组学部分，作者指出，pCCA的全局蛋白表达模式体现出明显的硬纤维性、炎症性及胆汁暴露生态位特征，尤其富集于细胞外基质重塑相关信号。与肝内胆管癌相比，pCCA更富集与分泌通路相关的上皮标志物及成纤维细胞相关标志物，提示其蛋白质组学信号深受导管分泌程序及间质成分影响。已有研究在肝外胆管癌中发现多种与黏蛋白分化及肿瘤–间质互作相关的蛋白上调，另有前瞻性研究识别出恶性与良性狭窄之间差异升高的蛋白。尽管目前尚缺乏pCCA特异性、样本量充分的磷酸化蛋白质组图谱，但有限证据提示细胞周期蛋白依赖性激酶、丝裂原活化蛋白激酶/受体酪氨酸激酶（MAPK/RTK）以及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）轴可能是重要的功能性磷酸化枢纽。糖蛋白质组学方面，研究显示不同CCA亚型在岩藻糖基化和唾液酸化模式上存在差异，并提示某些糖链结构在癌前及癌性病变中高频出现。
在诊断应用层面，胆汁与血清是pCCA蛋白质组学检测最现实的样本来源。文章列举了多种具有潜力的标志物，例如periostin（POSTN）在胆汁和血浆中均可有效区分恶性与非恶性胆道疾病，且与CA19-9联合时诊断表现进一步提升；clusterin（CLU）与CA19-9联合也可改善诊断效能。S100P在pCCA/肝外胆管癌中升高，且在胆道上皮内瘤变中亦有表达，提示其可能有助于更早期识别。细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）蛋白质组学则为另一重要方向，相关研究表明血清或胆汁EV中的蛋白特征可较好地区分CCA与PSC，尤其对早期病例具有潜力。糖蛋白质组学方面，胆汁中WFA-唾液酸化MUC1的敏感性优于细胞学与CA19-9，显示其在临床整合中的潜力。总体而言，这一部分强调蛋白质组学具有跨越低肿瘤细胞丰度限制的优势，而糖蛋白质组学比磷酸化蛋白质组学更接近实际诊断转化。
Genomics and methylomics
在基因组学与甲基组学部分，文章首先概述了pCCA的基因组特征。现有专门针对pCCA的较大样本研究显示，TP53、KRAS、NF1、SMAD4等为较常见突变基因。与肝内胆管癌不同，pCCA通常缺乏FGFR2融合及IDH1突变等高频可靶向改变，且肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）及拷贝数改变负荷（copy number alteration burden，CNAB）相对更低，提示其具有独特的分子谱。与此同时，文章强调甲基化异常是pCCA发生发展的关键表观遗传机制，启动子CpG岛高甲基化可沉默抑癌基因，并重塑癌相关信号通路。已有研究在pCCA中识别出多类异常甲基化基因，涉及细胞周期调控、DNA修复、Ras信号转导、Wnt通路调节及细胞黏附等关键生物过程。由于pCCA常发生于慢性胆道炎症背景，PSC本身亦可造成显著的表观遗传改变，因此甲基化标志物的临床验证必须纳入PSC及其他良性狭窄作为对照。
在诊断层面，作者指出胆汁来源cfDNA在pCCA基因组检测中优于血浆，不仅阳性驱动突变检出率更高，与组织的一致性也更好。BiliSeq等胆汁二代测序（next-generation sequencing，NGS）平台在CCA检测中优于CA19-9和常规病理学，且与细胞学联合后敏感性进一步提高。Bilemut等面向未定性胆道狭窄的检测亦显示出较高敏感性。相比之下，血浆ctDNA虽然可用于识别可操作靶点，但整体一致性及融合检测能力存在波动。甲基组学方面，多基因甲基化面板反复显示出优于单一标志物的表现，并能增强细胞学和CA19-9的诊断效能。部分研究在胆道刷检样本中构建的甲基化面板，对CCA与非恶性PSC的区分具有较高敏感性与特异性，甚至可早于现有诊断手段提示疾病。血浆cfDNA甲基化检测也展现出一定前景，但在PSC相关病例中的表现尚不稳定。总体来看，基因组学更偏向突变识别与精准分层，而甲基组学则在早期检出及炎症背景下的恶性识别方面更具吸引力。
Metabolomics and lipidomics
在代谢组学与脂质组学部分，作者指出pCCA位于持续暴露于胆汁流动、胆汁淤积及纤维炎症微环境的肝门部大胆管，其生化生态位高度动态，因此胆汁及血液中的代谢物和脂质谱极有可能反映肿瘤存在。代谢组学主要考察胆汁酸、氨基酸及氧化还原代谢物等小分子变化，脂质组学则关注甘油磷脂、鞘脂和固醇等结构与信号脂质。已有研究发现，CCA相关胆汁脂质谱与健康对照或良性疾病存在显著差异，例如溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）下调；血清外泌体脂质中磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰胆碱（PC）及LPC升高。与此同时，PSC本身亦伴随明显脂质组紊乱，再次说明开发诊断模型时选择恰当对照组的重要性。
胆汁代谢组学研究显示，pCCA与胆石症相比，在胆汁分泌、氨基酸代谢、辅因子生物合成及类固醇激素生物合成等通路上存在显著差异，且多种结合型胆汁酸发生改变。诊断应用方面，胆汁挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOC）模型对pCCA与良性胆道疾病的区分表现出很高的曲线下面积（area under the curve，AUC）；血浆胆汁酸谱中CDCA与TCDCA对CCA和良性胆道疾病的鉴别能力亦优于CA19-9。基于胆汁成分构建的多变量模型还可有效区分CCA与PSC。脂质组学方面，无论是胆汁脂质特征，还是外泌体脂质谱，均显示出较强的诊断潜力。作者据此认为，代谢组学和脂质组学不仅能够提供与肿瘤微环境紧密相关的功能性生化读出，而且因样本获取便利而具备较高转化价值。
Multiomic integration
在多组学整合部分，文章强调pCCA的生物学本质是多层级的，因此将蛋白质、脂质、代谢物、胆汁特征、遗传突变及甲基化信息进行整合，理论上可获得比单一组学更高的敏感性和特异性。已有研究通过神经网络整合蛋白质组学、脂质组学、代谢组学及胆汁特征，构建出表现优异的诊断面板；另有研究进一步联合胆汁微生物组、代谢组和其他特征，用于区分CCA、PSC与良性胆道疾病。BileScreen将突变与甲基化联合分析，尤其在ERCP病理可疑或阴性患者中的表现优于CA19-9。尽管专门针对血清多组学的研究仍较少，但已有工作通过机器学习整合血清脂质组与肽组特征，获得较高诊断准确性。该部分的核心观点是，多组学方法可通过整合相互独立的肿瘤信号，增强复杂临床场景下的鉴别能力。
Artificial intelligence in pCCA diagnosis
关于人工智能在pCCA诊断中的应用，作者指出人工智能（AI）、机器学习（machine learning，ML）及深度学习（deep learning，DL）正在同时推动影像诊断和分子标志物解析。针对PSC患者早期pCCA识别的多中心研究表明，DL模型可优于专家放射科医师。AI增强的胆道镜评估在胆道狭窄分类方面也优于刷检细胞学和活检。除影像外，AI亦越来越多地用于高维分子数据整合。多项研究已将深度学习、神经网络及支持向量机（support vector machine，SVM）应用于pCCA相关多组学特征提取、亚型分类与诊断建模。作者同时强调，若要推动AI真正进入临床，模型必须在pCCA特异性队列中训练，并纳入PSC和良性狭窄等临床相关对照，同时还需提高可解释性并开展前瞻性、多中心验证。
Future perspectives and conclusion
最后，文章总结认为，尽管pCCA组学诊断研究发展迅速，但目前文献仍高度碎片化，体现在样本类型、技术平台及解剖亚型混杂等多个层面。研究样本量不足是普遍问题，容易导致模型过拟合并夸大ROC曲线下面积。另一个关键限制是pCCA特异性分析不足，许多研究将肝内型、肝门部型和远端型胆管癌混合分析，导致难以提炼真正适用于肝门部狭窄场景的分子特征。作者建议未来研究应预先设定pCCA为主要亚组，并按肿瘤部位分层报告结果。
文章进一步指出，真实世界中最具挑战性的诊断场景主要发生于PSC相关狭窄及其他炎症性胆道疾病，但不少研究仅采用健康人或胆石症作为对照，这可能高估诊断性能。未来应采用与临床使用场景一致的匹配对照，并加强样本注释和质量控制。此外，当前缺乏组学检测与细胞学±FISH之间在同一队列中的前瞻性头对头比较，因此尚难明确这些新技术在临床算法中的最佳定位。作者还特别提出，pCCA特异性的磷酸化蛋白质组图谱仍明显匮乏，而多组学整合虽前景广阔，但模型开发应围绕具体临床决策节点展开，如未定性狭窄分诊、PSC监测与复发监测。总体而言，作者认为组学诊断正推动pCCA检测从单一标志物迈向具有生物学基础的多重分子特征体系；若能经过严格的前瞻性验证并合理嵌入临床流程，这些工具有望缩短诊断时间、提升诊疗决策质量，并扩大患者接受个体化根治性治疗的机会。
