《Fish Physiology and Biochemistry》：Fuelled by creatine: exploring two copies of the creatine transporter SLC6A8 gene in rainbow trout
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肌酸转运体（SLC6A8或CT1）在肌酸代谢中至关重要，其作为基本的细胞能量缓冲。研究人员在虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）基因组中鉴定出两个slc6a8基因变体，其编码序列相似性为69.3%。研究人员的分析表明，基因复制事件发生在硬骨鱼的共同
肌酸转运体（SLC6A8或CT1）在肌酸代谢中至关重要，其作为基本的细胞能量缓冲。研究人员在虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）基因组中鉴定出两个slc6a8基因变体，其编码序列相似性为69.3%。研究人员的分析表明，基因复制事件发生在硬骨鱼的共同祖先中，早于四足动物的分化。虽然一个拷贝在大多数脊椎动物谱系中丢失，但两个拷贝都在真骨鱼中保留。表达分析揭示了组织和细胞特异性调控：两个基因在心脏中高表达，slc6a8a在大多数组织中主要表达，而slc6a8b在肌肉和鲑科胚胎CHSE-214细胞中表现出显著升高的表达。与关键肌酸代谢酶（gatm、gamt、ckm）的共表达模式支持鱼类特异性肌酸稳态调控。结构分析确认了两种蛋白中均存在12个跨膜结构域和保守的功能关键糖基化基序。此外，Slc6a8a包含一个额外的细胞外氨基酸插入序列，带有一个额外的N-糖基化基序。荧光标记的Slc6a8a和Slc6a8b蛋白定位于CHSE-214细胞的质膜，而高效液相色谱分析确认了肌酸摄取。本研究首次表征了硬骨鱼中复制的slc6a8基因，并提示它们在真骨鱼进化过程中的亚功能化，可能反映了旁系同源物的功能特化。研究人员假设一个变体可能主要介导肌酸摄取，而另一个变体可能在特定生理条件下参与不同组织中的肌酸释放。
论文解读文章
**研究背景与目的**
肌酸系统作为高能磷酸键的细胞能量缓冲，在快速补充三磷酸腺苷（ATP）供应中发挥关键作用，尤其对脑、心脏和肌肉等高能量需求组织至关重要。肌酸通过饮食获取或经由甘氨酸脒基转移酶（GATM）和胍基乙酸N-甲基转移酶（GAMT）两步酶促反应内源性合成，磷酸化/去磷酸化则由肌酸激酶（CKs）催化。细胞从血液中摄取肌酸依赖于钠-氯依赖性肌酸转运体1（SLC6A8或CT1），该蛋白属于溶质载体6（SLC6）家族。在人类中，SLC6A8基因突变与肌酸缺乏综合征、智力发育迟缓等疾病相关；在小鼠中，功能性肌酸转运对免疫至关重要。然而，水生脊椎动物尤其是真骨鱼类的肌酸系统及膜转运体Slc6a8尚不清楚。已有研究表明，鱼类与哺乳动物在肌酸合成上存在差异：哺乳动物中肌酸合成与利用空间分离，而鱼类肌肉中高表达肌酸合成酶（gatm、gamt），且对精氨酸、甘氨酸及S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的处理不同，提示鱼类存在肌肉特异性肌酸合成。因此，本研究旨在进一步阐明真骨鱼类肌酸系统，特别是肌酸转运的机制，以虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）为模型，表征复制的slc6a8基因变体，并探讨其结构、功能及进化意义。该研究成果发表在《Fish Physiology and Biochemistry》。
**主要技术方法**
研究人员综合运用了多种分子和生化技术：利用实时定量PCR（qPCR）分析虹鳟鱼七个组织（心脏、脑、脾、头肾、鳃、肌肉、肝脏）及鲑科胚胎细胞系CHSE-214中slc6a8a和slc6a8b的表达，并基于RNA-seq数据（BioProject PRJNA638521，共16个心脏和16个骨骼肌样本，来自两个虹鳟鱼品系）分析肌酸代谢酶基因（gatm、gamt、ckm）的表达；通过构建绿色荧光蛋白（GFP）和紫色荧光蛋白（mPlum）融合表达质粒，在人类胚胎肾细胞HEK293中进行共聚焦显微镜活细胞成像，以确定蛋白亚细胞定位；采用高效液相色谱（HPLC）检测虹鳟鱼相关物种（Maraena白鲑）及牛肌肉提取物中的肌酸，并测定CHSE-214细胞在添加外源肌酸后的肌酸摄取；此外，通过生物信息学方法，包括系统发育分析、序列比对、跨膜结构域预测、N-糖基化位点预测、三维同源建模等，对Slc6a8蛋白进行结构分析。
**研究结果**
**1. 虹鳟鱼中肌酸转运体基因slc6a8存在复制**
研究人员在虹鳟鱼基因组中鉴定出两个slc6a8基因变体，分别命名为slc6a8a（XM_036947549）和slc6a8b（XM_021566996），均位于16号染色体。两者外显子-内含子结构不同：slc6a8a包含14个外显子和13个内含子，slc6a8b包含13个外显子和12个内含子；开放阅读框（ORF）长度分别为2055 bp和1974 bp，编码蛋白分别含684个和657个氨基酸，序列相似性为69.3%。Slc6a8a较Slc6a8b多出28个氨基酸的插入序列，位于跨膜结构域（TM）3和4之间的大细胞外环，并含有一个额外的N-糖基化基序。两种蛋白均具有12个跨膜结构域，N端和C端朝向胞质侧，钠离子和底物结合位点保守。
**2. 复制的slc6a8拷贝在大多数真骨鱼类中保留，而一个变体在进化中丢失**
通过搜索NCBI和Ensembl数据库，研究人员发现12种鲑科鱼类中有11种具有两个slc6a8基因拷贝，85%有数据库记录的真骨鱼类存在两个变体的直系同源物。在四足动物中，鸟类保留Slc6a8a变体，爬行类、两栖类（除热带爪蟾外）及哺乳类保留Slc6a8b变体。这表明复制事件发生在硬骨鱼共同祖先（约3.8亿年前四足动物分化之前），而在四足动物后续进化中其中一个变体丢失。共线性分析进一步确认slc6a8a和slc6a8b为旁系同源，两者侧翼基因不同。系统发育树显示，鱼类的SLC6家族蛋白与高等脊椎动物分离形成独立分支，且虹鳟鱼两个Slc6a8旁系同源与鉴定出的直系同源变体聚类。
**3. Slc6a8a和slc6a8b基因表现变体特异性表达模式**
qPCR分析显示，在未处理的成年虹鳟鱼七个组织中，slc6a8a和slc6a8b的转录水平均在心脏中最高，但两者存在显著差异。slc6a8a主要在脑、脾、头肾中高表达，在鳃中中等表达，在肌肉和肝脏中表达极低；而slc6a8b在肌肉中强烈表达，在脑中中等，在肝脏中弱表达，其余组织表达可忽略。在肌肉中，slc6a8b转录水平显著高于slc6a8a达25倍。RNA-seq数据分析显示，gatm和gamt在骨骼肌中高表达（每百万读段每千碱基分别118和575次命中），而在心肌中极低（<2次命中）；ckm在两种组织中均有表达，但骨骼肌中表达量比心肌高20倍。这表明虹鳟鱼心脏无法自主合成肌酸，需依赖肌酸导入，而骨骼肌可能具备内源合成能力，因此两种变体存在组织特异性分工。
**4. Slc6a8在细胞亚结构中的空间定位**
通过在HEK293细胞中表达GFP标记的Slc6a8a和Plum标记的Slc6a8b，共聚焦显微镜显示两种变体均定位于细胞膜，与牛磺酸转运体Slc6a6定位一致。线扫描分析显示荧光强度在细胞外边缘最高，确认膜定位。
**5. 鲑科肌肉提取物肌酸检测及Slc6a8转运功能的HPLC分析**
在鲑科细胞系CHSE-214中，内源性slc6a8a转录水平较高，而slc6a8b极低。HPLC分析显示，外源添加20 mM肌酸后，CHSE-214细胞裂解液中肌酸浓度从0.52 mM显著升高至0.83 mM（p=0.003），证实了载体介导的肌酸摄取。但由于内源性slc6a8a高表达，该实验无法明确区分slc6a8a和slc6a8b各自的贡献。
**讨论与结论**
讨论部分指出，与哺乳动物不同，鱼类中肌酸合成酶在肌肉中高表达，而心脏依赖肌酸摄取，这一差异可能与两个肌酸转运体变体的亚功能化相关。研究人员假设Slc6a8a主要介导肌酸摄取，Slc6a8b可能在特定生理条件下（如肌肉高内源合成导致胞内肌酸浓度升高、钠梯度降低时）参与肌酸释放。但由于SLC6家族转运方向由离子电化学梯度决定，该假设仍需通过功能性转运实验（如非洲爪蟾卵母细胞异源表达系统结合基因敲除）进一步验证。研究结论总结为：研究人员在虹鳟鱼中从结构和功能角度表征了两个肌酸转运体slc6a8基因变体，证实了其膜转运体分类，并提示其在组织和鲑科细胞模型中的亚功能化；还展示了真骨鱼与高等脊椎动物在slc6a8复制保留上的差异；变体特异性表达模式与关键肌酸代谢酶分布共同支持鱼类存在进化上独特的肌酸代谢。未来研究需深入探索这两个变体是否在不同组织中分别作为肌酸进口和出口载体发挥作用。
