Hexon蛋白第188位残基通过激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬调控FAdV-4的致病性

《Veterinary Research》：Residue 188 of the Hexon protein governs FAdV-4 pathogenicity by activating PINK1/Parkin-mediated mitophagy

　　

禽腺病毒血清4型（FAdV-4）感染给全球家禽业造成重大经济损失。病毒常劫持宿主细胞机制以促进其复制，然而FAdV-4操纵宿主通路的机制仍未明确。线粒体是肝细胞和心肌细胞中能量代谢与先天免疫的中心枢纽，是病毒操纵的关键靶点，但其在FAdV-4发病机制中的作用尚待探索。研究人员证明，FAdV-4感染在体外和体内均直接引起线粒体损伤，并诱导PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬。此外，该病毒主动劫持PINK1/Parkin介导的线粒体自噬以增强其在LMH细胞中的复制。抑制线粒体自噬导致致病性FAdV-4在LMH细胞中的病毒复制平均降低十倍（p<0.05）。值得注意的是，Hexon蛋白中第188位残基（关键毒力决定因子）差异性调控线粒体自噬：致病性FAdV-4中的R188I突变减弱了线粒体自噬，而非致病性FAdV-4中的I188R突变则增强了该过程。本研究阐明了FAdV-4利用线粒体自噬促进病毒复制的机制，并确立Hexon第188位残基及线粒体自噬通路为开发抗禽腺病毒疾病新型疗法的首要靶点。

禽腺病毒血清4型（FAdV-4）是引起鸡肝炎-心包积水综合征（HHS）的病原，给全球家禽业造成重大经济损失。Hexon蛋白第188位残基是FAdV-4毒力的关键决定因子，但其调控致病性的细胞机制尚未阐明。线粒体作为肝细胞和心肌细胞能量代谢与先天免疫的中枢，在病毒感染中常被劫持，但FAdV-4如何影响线粒体质量控制尤其是线粒体自噬（mitophagy，一种选择性自噬清除受损线粒体的过程）仍未知。本研究旨在系统揭示FAdV-4诱导的线粒体损伤及线粒体自噬，并探讨Hexon第188位残基在此过程中的调控作用，为开发抗禽腺病毒疾病的新策略提供靶点。论文发表在《Veterinary Research》。

研究人员开展的研究：利用高致病性FAdV-4毒株HNJZ（GenBank登录号KU558760）、非致病性毒株ON1（GenBank登录号GU188428）及其定点突变重组病毒H/H/R188I（将HNJZ的Hexon第188位精氨酸突变为异亮氨酸）和O/O/I188R（将ON1的Hexon第188位异亮氨酸突变为精氨酸），通过体外感染LMH细胞（鸡肝癌细胞系，ATCC, CRL-2117）和体内感染SPF白来航鸡（北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司）实验，证明FAdV-4通过劫持PINK1/Parkin介导的线粒体自噬促进病毒复制，且Hexon第188位残基是调控该过程的关键分子。结论：Hexon第188位残基通过激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬决定FAdV-4致病性，抑制线粒体自噬可显著降低病毒复制，为抗病毒治疗提供新靶点。

关键的技术方法：采用透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构；JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（MMP）；RT-qPCR和Western blot检测线粒体自噬相关基因（PINK1、Parkin、LC3、P62、Beclin、ATGs）的mRNA和蛋白表达；免疫荧光共定位检测LC3与线粒体标志物TOM20。使用环孢素A（CsA，线粒体通透性转换孔抑制剂）或Parkin siRNA（siParkin）进行药理学和遗传学抑制线粒体自噬，评估病毒复制变化。

研究结果：
**Pathogenic FAdV-4 infection induces mitochondrial damage and mitophagy in LMH cells**：通过JC-1染色发现HNJZ和O/O/I188R感染显著降低LMH细胞MMP（p<0.05）；TEM显示这些细胞中线粒体出现基质空泡化和嵴紊乱；RT-qPCR和Western blot表明HNJZ感染上调PINK1、Parkin、LC3-II/LC3-I比值及ATG基因表达，并下调P62，而H/H/R188I和ON1组变化较弱；免疫荧光显示HNJZ和O/O/I188R组LC3与TOM20共定位增强，证实线粒体自噬激活。

**Pathogenic FAdV-4 infection induces mitochondrial damage and mitophagy in hepatocytes in vivo**：在SPF鸡肝细胞中，HNJZ感染引起严重线粒体肿胀、膜破裂；RT-qPCR显示Parkin、PINK1、Beclin、ATG3、ATG4A/B、ATG5、ATG9、ATG12 mRNA显著上调；Western blot显示48 hpi时HNJZ组LC3-II/LC3-I比值和Parkin蛋白升高，P62降低，72 hpi时这些指标下降，提示线粒体自噬具有时间依赖性。

**Pathogenic FAdV-4 infection induces mitochondrial damage in cardiomyocytes in vivo**：心肌细胞TEM显示HNJZ和O/O/I188R损伤严重（嵴紊乱、膜破裂），ON1和H/H/R188I损伤较轻；RT-qPCR表明HNJZ组Parkin、PINK1、Beclin、ATG4A/B、ATG9、ATG12 mRNA显著上调；Western blot显示48 hpi时HNJZ组Parkin升高、P62降低，LC3-II/LC3-I比值在72 hpi时显著高于其他组，表明线粒体自噬激活。

**Inhibiting mitophagy suppressed FAdV-4 replication**：用CsA（1 μM）预处理LMH细胞抑制线粒体自噬后，所有FAdV-4毒株的病毒载量平均降低约10倍（p<0.01）；转染siParkin敲低Parkin后，HNJZ、H/H/R188I、ON1组病毒复制均显著受抑（p<0.01），证实线粒体自噬促进FAdV-4复制。

**讨论与结论总结**：讨论部分指出线粒体自噬在病毒感染中具有双重作用，FAdV-4通过劫持PINK1/Parkin通路利用线粒体自噬促进自身复制。Hexon第188位残基是调控此过程的关键毒力决定因子：R188I突变减弱线粒体自噬并降低致病性，I188R突变则增强线粒体自噬并提高致病性，但完全致死表型还需其他毒力因子（如Fiber-2）参与。药理学和遗传学抑制线粒体自噬均能显著抑制病毒复制，表明该通路是抗病毒治疗的潜在靶点。研究结论：Hexon第188位残基通过激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬调控FAdV-4致病性；靶向线粒体自噬通路或Hexon第188位残基可为开发减毒活疫苗和抗病毒药物提供新策略。同时，研究受限于缺乏鸡源ATG抗体及动物样本量较小，未来需进一步解析Hexon与线粒体自噬机制的分子互作。