《Veterinary Research》：Cross-species transmission of host adaptation of feline leukemia virus between domestic cats and the wild felid Leopardus guigna
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猫白血病病毒（Feline Leukemia Virus, FeLV）广泛流行于家猫群体，并频繁溢出至野生猫科动物种群，导致非家养猫科动物种群中的严重疫情暴发。家猫携带内源性猫白血病病毒（endogenous FeLV, enFeLV）和外源性猫白血病病毒（e
猫白血病病毒（Feline Leukemia Virus, FeLV）广泛流行于家猫群体，并频繁溢出至野生猫科动物种群，导致非家养猫科动物种群中的严重疫情暴发。家猫携带内源性猫白血病病毒（endogenous FeLV, enFeLV）和外源性猫白血病病毒（exogenous FeLV, exFeLV），二者可发生重组，产生具有替代受体用途的新变异株。相比之下，包括小斑虎猫（guigna）在内的大多数非家养猫科动物不携带enFeLV。本研究应用猫白血病病毒包膜基因扩增结合Illumina测序技术，对原产于智利和阿根廷的小型野生猫科动物小斑虎猫（Leopardus guigna）中的猫白血病病毒包膜基因多样性和传播动态进行了表征。研究人员对5只自由活动小斑虎猫的7个聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）扩增子进行了测序。Illumina测序成功完成，后续系统发育分析表明，检测到的感染与智利家猫中流行的毒株关系最为密切。然而，研究鉴定出一个具有独特序列变异的小斑虎猫特异性聚类簇，提示猫白血病病毒在小斑虎猫之间也存在独立于家猫的传播。系统发育分析显示，所有小斑虎猫序列形成一个智利特异性的猫白血病病毒进化分支，与家猫病毒密切相关，但与国际猫白血病病毒-A（FeLV-A）毒株明显分离。
本研究发表于《Veterinary Research》，旨在探讨猫白血病病毒在野生猫科动物小斑虎猫中的遗传多样性、传播模式及宿主适应性问题。
研究背景与问题提出：猫白血病病毒属于逆转录病毒科（Retroviridae）γ逆转录病毒属（Gammaretrovirus），是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组长约8.4 kb，包含gag、pol和env三个主要基因，两端为长末端重复序列（Long Terminal Repeats, LTRs）。该病毒可通过水平传播（如唾液、尿液、粪便、乳汁、鼻分泌物等途径）和垂直传播（胎盘、分娩、哺乳）感染家猫，引起免疫抑制、骨髓抑制、淋巴瘤、白血病等多种临床症状，是威胁家猫健康最重要的病原体之一。猫白血病病毒同样严重威胁野生猫科动物健康，已在伊比利亚猞猁（Lynx pardinus）和佛罗里达美洲狮（Puma concolor coryi）等濒危物种中造成种群数量锐减的灾难性后果。家猫作为多数非家养猫科动物感染猫白血病病毒的主要来源，构成了野生动物与家养动物交界面的关键病原体。
研究问题的核心在于：大多数非家养猫科动物缺乏内源性猫白血病病毒，这为研究外源性病毒进化提供了独特机会；而南美洲智利的小斑虎猫种群显示出高于佛罗里达美洲狮或伊比利亚猞猁的猫白血病病毒阳性率（大于20%），其感染来源、病毒基因特征及传播动态尚不明确。此外，现有研究多依赖保守的LTR区域诊断PCR，缺乏对包膜基因（env）全长的下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）分析，无法深入解析病毒变异、受体使用及种间适应机制。因此，研究人员假设小斑虎猫的猫白血病病毒感染主要来源于家猫，但也存在小斑虎猫个体间的后续传播，导致独特的病毒变异和宿主内突变模式。
研究采用的关键技术方法：样本来源于先前通过LTR区域PCR检测猫白血病病毒阳性的自由活动雄性小斑虎猫，采样地点覆盖智利中南部四个地区的农村区域。研究采用两对引物进行终点PCR扩增包膜基因高变区及3'端LTR区域，产物经Illumina HiSeq4000平台双端测序（300 bp插入片段，30×覆盖度）。数据分析流程包括：FastP进行质量控制、MEGAHIT进行从头组装、Bowtie2比对至猫白血病病毒-A FAIDS参考株（M18247）、MAFFTv7进行多序列比对、IQ-TREE构建最大似然系统发育树（TIM2+F+G4核苷酸替代模型，1000次超快速bootstrap），以及使用BWA-MEM和iVar进行宿主内单核苷酸变异（Intrahost Single-Nucleotide Variation, iSNV）分析（质量阈值Q>10，变异频率>1%）。
研究结果部分：
样本与扩增结果：20份小斑虎猫样本中，9份猫白血病病毒-A引物阳性，8份猫白血病病毒-B引物阳性。最终从5只个体获得5份猫白血病病毒-A扩增子和2份猫白血病病毒-B扩增子，所有重叠群长度约1.9 kb。值得注意的是，猫白血病病毒-B特异性引物仅扩增出附带随机核苷酸的猫白血病病毒-A序列，未检出真正的猫白血病病毒-B。
系统发育分析结果：小斑虎猫序列在系统发育树上形成高支持率（大于90% bootstrap值）的独立聚类簇，与智利家猫聚类簇相邻，且位于包含猫白血病病毒-FAIDS和Rickard参考株的更大分支内。该小斑虎猫分支与来自美国的1份美洲狮序列邻近，但与欧洲、巴西、日本等国际猫白血病病毒-A毒株明显分离，构成智利特异性的猫白血病病毒谱系。
宿主内变异分析结果：7份扩增子共鉴定出96个iSNV，涉及43个独特核苷酸位点，个体间差异显著（每动物2-52个）。变异主要分布于表面蛋白（Surface Unit, SU）区域（50个），其次为跨膜蛋白（Transmembrane Protein, TM）区域（34个）和LTR区域（7个）。编码区84个iSNV中，20个为同义突变，64个为非同义突变。G→A转换最为常见（57次，62.6%），其中15个非间义iSNV中的13个符合APOBEC典型基序（AGG或GGG），提示APOBEC介导的编辑作用。一个显著发现是TM区域iSNV比例异常增高（占38.6%），与家猫中TM高度保守的典型模式形成对比。研究还鉴定出4个小斑虎猫与智利家猫之间的特征性氨基酸变异：VRA区域59位丝氨酸（Ser，家猫为天冬氨酸或天冬酰胺）、60位丝氨酸/脯氨酸多态性（家猫为脯氨酸），以及165位精氨酸/赖氨酸多态性；249位亮氨酸则为所有智利株系（包括家猫和小斑虎猫）特有变异。
讨论部分核心要点：研究结果确认了家猫是小斑虎猫猫白血病病毒感染的主要源头，智利特异性猫白血病病毒-A谱系的流通体现了地域性传播特征。同时，小斑虎猫特异性聚类簇的存在及独特突变表明，该物种内已建立独立于家猫的持续传播链。与佛罗里达美洲狮和伊比利亚猞猁等顶级捕食者不同（其通过捕食家猫获得感染），小斑虎猫作为美洲最小野生猫科动物（约2 kg），与家猫的接触主要发生在森林边缘的农村人类聚居区，涉及偷猎家禽或领域重叠引发的攻击性行为。
研究人员特别指出，小斑虎猫包膜基因变异模式的特殊性——尤其是TM区域异常高的变异比例——可能与物种间APOBEC3抗病毒系统的差异互作有关。小斑虎猫属于Leopardus谱系，于约800万年前与家猫谱系分化，其APOBEC3系统可能对家猫来源的猫白血病病毒产生不同的编辑压力，导致病毒基因组超突变。这一假说与此前美洲狮猫免疫缺陷病毒（Feline Immunodeficiency Virus, FIV）跨种感染效率的研究相印证，但尚需实验验证。
与伊比利亚猞猁类似，小斑虎猫感染可能多处于退行性感染状态（病毒复制受控），这解释了长片段扩增困难、临床征象少见及血清学阴性等现象。研究还比较了其他两例非家养猫科动物的NGS研究，强调了Illumina测序在变异检测中的有效性，以及小斑虎猫缺乏enFeLV在减少分析干扰方面的优势。
研究结论：本研究首次利用Illumina测序技术全面表征了小斑虎猫猫白血病病毒包膜基因的遗传多样性和传播动态。主要结论包括：（1）小斑虎猫感染的猫白血病病毒与智利家猫流行毒株密切相关，证实家猫为主要感染来源；（2）存在小斑虎猫特异性病毒聚类簇，提示种内独立传播已建立；（3）鉴定出独特的氨基酸变异和宿主内突变模式，特别是TM区域的高变异性，可能与APOBEC3抗病毒压力及病毒宿主适应相关；（4）249位亮氨酸变异为智利株系特有标志。这些发现强调了持续监测家猫和小斑虎猫种群中猫白血病病毒的重要性，并为该濒危物种的潜在疾病管理策略（如疫苗接种、感染个体隔离、种群调控等）提供了科学依据。鉴于智利快速的城市扩张和生境破碎化加剧了家猫与小斑虎猫的接触，猫白血病病毒的跨物种传播风险将持续增加，早期发现和分子监测对于保护这一易危物种至关重要。
