通过点击化学偶联补体融合蛋白抑制剂对纳米表面调理素化(opsonisation)进行生物正交调控

《Chemical Communications》：Bioorthogonal tuning of nanosurface opsonisation via click coupling of a complement fusion protein inhibitor

　　

补体调理素化(complement opsonisation)参与纳米药物(nanopharmaceuticals)的免疫清除，但补体激活会产生一些不良影响。本文研究表明，通过聚乙二醇(PEG)间隔基和铜-free点击化学反应将补体受体2–补体受体1(CR2-CR1)调节融合蛋白锚定于交联氧化铁纳米蠕虫(cross-linked iron oxide nanoworms)表面，可克服补体调理素化。此外，偶联CR2-CR1的纳米蠕虫可降低未修饰纳米颗粒的补体调理素化水平。

论文解读：通过点击化学偶联补体融合蛋白抑制剂对纳米表面调理素化进行生物正交调控

本研究发表于《Chemical Communications》。纳米药物(nanopharmaceuticals)进入体内后常触发补体系统(complement system)激活，导致C3裂解片段（C3b、iC3b、C3dg、C3d等）共价沉积于纳米颗粒表面形成补体调理素化(complement opsonisation)，进而被巨噬细胞识别清除，缩短体内循环时间；同时补体活化释放过敏毒素C3a/C5a及膜攻击复合物C5b-9可引发炎症与心血管不良反应。天然补体调节蛋白如CD35(CR1)、CD55、CD59、因子H及C1-抑制剂(inhibitor)已被开发为全身性补体抑制剂用于治疗补体依赖性疾病，但全身给药会导致宿主免疫抑制及感染风险增加（如FDA对iptacopan的黑框警告）。将天然补体调节蛋白通过化学修饰或脂锚固定于生物材料表面可在局部抑制补体活化而不引起全身性抑制，是改善纳米载体生物相容性的策略。研究人员此前开发了可溶性120 kDa CR2–CR1融合调节蛋白——CR2可结合C3片段调理的表面，CR1可抑制C3转化酶(C3 convertase)，在溶液中具有纳摩尔级抑制效力且能完全抑制纳米颗粒诱导的补体激活及急性反应，无明显长期补体抑制。本文在此基础上，研究人员通过生物正交无铜点击化学将CR2-CR1共价偶联至聚乙二醇化交联葡聚糖包被氧化铁纳米蠕虫(cross-linked dextran iron oxide nanoworms, CLIO NWs)表面，探究表面锚定CR2-CR1对纳米颗粒自身C3调理素化的抑制作用及其对未保护纳米颗粒和聚乙二醇化脂质体在trans（反向/旁位）的补体抑制能力。

主要关键技术方法

研究人员采用交联葡聚糖包被氧化铁纳米蠕虫(CLIO NWs)，经环氧氯丙烷交联及PEG₃₄₀₀修饰引入甲基四嗪(MTz)得到CLIO NW-PEG₃₄₀₀-MTz（简称CLIO NW），再与反式环辛烯(TCO)修饰的CR2-CR1融合蛋白通过无铜Diels–Alder点击反应（TCO–MTz逆电子需求狄尔斯–阿尔德反应，iEDDA）偶联制得CLIO NW-CR2-CR1。以人血清（来自多名供体，含62岁女性及另3名不同性别年龄供体）为补体来源，通过定量免疫斑点印迹(dot-blot)及蛋白质免疫印迹(Western blot)检测总C3沉积及α'链裂解片段α'₂以评估C3调理素化程度；以EDTA为阳性对照；将CLIO NW-CR2-CR1按不同铁含量比例(Fe%)掺入未修饰CLIO NW或PEG化阿霉素脂质体(PLD)中检测trans抑制效应并测定半数抑制浓度(IC₅₀)；另制备PEG₃₄₀₀连接的人血清白蛋白(HSA)-CR2-CR1可溶性对照比较抑制效力。

研究结果

纳米颗粒修饰与表征

研究人员将CLIO NWs经PEG₃₄₀₀-MTz功能化后，与TCO-CR2-CR1通过无铜点击化学偶联，每纳米蠕虫平均偶联36个CR2-CR1分子。流体力学直径由修饰前约63 nm增至78 nm，Zeta电位由?2 mV变为+12 mV，颗粒在4℃ PBS中胶体稳定至少3个月。

CR2-CR1偶联抑制纳米蠕虫自身C3调理素化并具有trans抑制活性

Western blot及dot-blot显示，CLIO NW-CR2-CR1表面C3总沉积显著低于未偶联CLIO NW，且几乎无C3 α链裂解片段α'₂，表明C3转化酶活性受抑。10 mM EDTA可阻断CLIO NW的C3沉积但对已低沉积的CLIO NW-CR2-CR1无进一步降低作用。向CLIO NW中加入5%（按Fe含量）CLIO NW-CR2-CR1可显著减少CLIO NW的C3沉积与裂解，剂量—效应曲线测得IC₅₀约为73 nM，证明表面锚定CR2-CR1兼具cis（自身保护）与trans（抑制邻近未保护颗粒补体激活）抑制功能。

不同供体血清中的普适性验证

在来自3名额外供体的人血清中，CLIO NW-CR2-CR1均能有效抑制CLIO NW的C3沉积与α链裂解，各供体中EDTA几乎完全阻断CLIO NW的C3沉积但无法进一步降低CLIO NW-CR2-CR1上已很低的C3信号，提示残留C3为非特异性沉积的天然C3或C3(H₂O)。

抑制PEG化阿霉素脂质体的C3调理素化

PEG化阿霉素脂质体(PEGylated liposomal doxorubicin, PLD)在人血清中被C3调理化且可被EDTA抑制；加入5% v/v CLIO NW-CR2-CR1可显著降低PLD的C3沉积与裂解，而未偶联CR2-CR1的空白CLIO NW无此效果，表明CLIO NW-CR2-CR1可对易受补体攻击的PEG化制剂发挥trans保护作用。

PEG间隔基与表面多位点偶联对抑制效力的影响

研究人员将CR2-CR1通过相同PEG₃₄₀₀间隔基偶联至人血清白蛋白(HSA)制成可溶性HSA-CR2-CR1，其抑制CLIO NW上C3调理素化的IC₅₀为32 nM，较表面偶联形式（73 nM）低约2倍。研究人员认为纳米蠕虫表面平均负载36个CR2-CR1呈多价态，C3转化酶（如替代途径C3bBb，约15 nm×10 nm×8 nm）空间较大，表面随机分布的CR2-CR1存在空间位阻致部分分子无法有效结合转化酶而冗余；此外表面正电性可能吸附带负电血浆蛋白造成空间拥挤，以及表面结合型CR2-1对表面形成vs液相转化酶的亲和力差异也可能影响表观IC₅₀。

讨论与结论（翻译浓缩）

综上所述，将CR2-CR1功能化于纳米颗粒表面为设计补体逃逸(entity evading complement opsonisation)体系提供了通用策略，此类构建体不仅能抑制自身C3激活，还可在trans抑制未保护纳米颗粒及易遭补体攻击的PEG化物种（如脂质体）的补体活化。纳米药物引发的补体失调与过度激活可诱发炎症反应、心血管窘迫并促进疾病进展（如免疫活性小鼠模型中肿瘤内补体激活促进肿瘤生长），因此CR2-CR1偶联纳米颗粒还可能作为癌症治疗的辅助手段。后续需考察CR2-CR1偶联纳米颗粒的药代动力学、生物分布、安全性及其与联用纳米药物（如PLD）生物学性能的交互影响。鉴于表面偶联形式抑制效力低于可溶性CR2-CR1，未来可借助人工智能与机器学习优化偶联策略以克服空间位阻与取向问题，设计具可调补体响应及佐剂特性的新型补体融合蛋白构建体与纳米颗粒文库。