用于骨软骨再生的整合HAP与KGN@Lip的3D打印双层水凝胶支架

《Journal of Materials Chemistry B》：3D-printed bilayer hydrogel scaffolds incorporating HAP and KGN@Lip for osteochondral regeneration

　　

骨软骨缺损需要关节软骨与软骨下骨的同步再生，这对现有生物材料策略构成了重大挑战。研究人员提出了一种径向取向的3D打印双层水凝胶支架，其由机械增强的GelMA/HAP成骨层与柔顺的、负载KGN@Lip的GelMA成软骨层组成，以实现协调性的骨软骨修复。结构与理化表征证实该支架形成了功能梯度化结构，且HAP与KGN@Lip分布均一；与此同时，力学、流变、溶胀及降解分析表明该支架具有层依赖性梯度特征，与天然骨软骨界面的部分结构特征相似。体外实验表明，GelMA/HAP层可通过离子介导的成骨通路激活，促进稳健的成骨分化；而GelMA/KGN@Lip层则可维持成软骨刺激，并显著增强SOX9、Col2a1和Acan的表达。径向取向微通道提供了相互连通的结构，可能有助于营养运输与细胞浸润。体内植入结果显示，该支架可显著促进软骨下骨再生及类软骨组织形成，并改善基质组织化程度，同时增强骨软骨界面的整合，证实其能够提供空间协调的生化与结构线索。总体而言，这种各向异性双层水凝胶支架为一体化、功能性骨软骨再生提供了一种有前景的策略。

该论文发表于《Journal of Materials Chemistry B》，围绕骨软骨缺损修复这一组织工程难题，构建了一种兼具分层组成、各向异性结构与局部生物活性递送功能的3D打印双层水凝胶支架，并系统评估其在软骨下骨与关节软骨协同再生中的应用潜力。骨软骨缺损常由创伤、骨关节炎或退行性疾病引起，病变同时累及关节软骨与软骨下骨。由于软骨组织缺乏血管供应，而软骨下骨又具有特殊的矿化结构与力学属性，天然状态下此类复合组织的自我修复能力极其有限。更重要的是，骨软骨界面一旦遭到破坏，局部力学平衡和组织耦联关系随之失调，进而诱发持续性关节退变。现有临床方法如微骨折、自体或异体移植及软骨细胞植入虽可在一定程度上改善缺损，但往往难以同时重建软骨层、软骨下骨层以及两者之间的连续界面，也难以恢复长期稳定的组织功能。因此，开发能够同时诱导成骨与成软骨、且在空间结构和力学性质上接近天然骨软骨组织的仿生支架，具有明确的科学意义与转化价值。

该研究的核心思路是模拟天然骨软骨组织的层级化特征：下层为偏硬、富矿化、具备成骨诱导能力的软骨下骨样区域，上层为较柔软、含水丰富、具备持续成软骨信号的软骨样区域。研究人员选用甲基丙烯酰化明胶（GelMA，gelatin methacryloyl）作为基础水凝胶基体，这是因为其具有良好的生物相容性、可光交联性以及细胞黏附相关基序。针对骨再生需求，在下层GelMA中引入羟基磷灰石（HAP，hydroxyapatite）纳米颗粒，以提高力学强度并提供Ca²⁺和PO₄^3?相关成骨刺激。针对软骨再生需求，在上层GelMA中装载卡托吉宁脂质体（KGN@Lip，kartogenin-loaded liposomes），借助脂质体递送改善KGN疏水性与体内快速清除的问题，从而实现更持久的成软骨信号维持。基于此，研究人员设计并制备了带有径向取向微通道的双层打印结构，希望在实现双层生化分工的同时，借助开放互联的通道促进营养扩散、细胞迁移及界面整合。

主要技术方法可概括如下：研究人员首先通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）与¹H核磁共振（¹H NMR）表征GelMA化学修饰；采用动态光散射（DLS）与透射电子显微镜（TEM）分析KGN@Lip粒径、形貌及包封情况，利用X射线衍射（XRD）确认HAP晶相；通过3D打印构建双层水凝胶，并结合扫描电子显微镜（SEM）、能谱映射（SEM-EDS）、压缩测试、流变、溶胀、降解与体外释药实验进行材料学评价。生物学方面，采用骨髓间充质干细胞（BMSCs，bone marrow mesenchymal stem cells）开展细胞相容性、成骨分化与成软骨分化实验；体内部分采用24只雄性新西兰大白兔股骨滑车全层骨软骨缺损模型，并以micro-CT、组织学染色、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）进行修复效果评价。

在结果部分，论文首先以“Characterization of HAP and KGN@Lip nanoparticles”为题，证明了两类功能组分具备良好构建基础。XRD结果显示HAP具有明确晶相与较好结晶性，TEM观察到其呈均一棒状形貌，这为其在GelMA中的均匀分散和成骨增强作用提供了结构依据。对于KGN@Lip，研究人员测得载药率为14.70 ± 0.27%，包封率为87.83 ± 0.16%，说明脂质体对KGN具有较高装载效率。DLS结果显示载药后粒径由388.99 ± 3.90 nm增至503.93 ± 4.45 nm，提示载药成功且胶体稳定性未明显受损；TEM进一步证实其保持球形与完整双层结构。

在“Structural evaluation of hydrogels”部分，研究人员验证了GelMA制备成功以及双层支架结构成形准确。FT-IR中酰胺相关吸收峰增强，¹H NMR中5.3与5.6 ppm处出现甲基丙烯酸酯基团乙烯基质子峰，表明明胶成功甲基丙烯酰化。宏观图像、侧视观察及数字模型对照显示，实际打印支架能够较好复现预设双层结构：上层具有双重径向互联通道，下层为无通道实体底座。SEM显示支架具有连续微孔结构；SEM-EDS进一步表明下层存在Ca与P元素富集，而上层以C、N、O信号为主，从而证实功能分层与成分分布的合理性。

在“Mechanical and physicochemical characterization of dual-component hydrogel scaffolds”部分，研究人员说明了双层支架在力学和理化性能上的梯度特征。压缩结果表明，GelMA/HAP层在40%应变下压缩强度为35.13 kPa，显著高于GelMA/Lip层的25.35 kPa，说明HAP起到纳米填料与增强锚点作用。流变结果中，两组水凝胶的储能模量G′均高于损耗模量G″，提示形成稳定凝胶网络，而GelMA/HAP层表现出更高的弹性与黏弹性。溶胀实验显示GelMA/Lip层具有更高吸水能力，降解实验则显示GelMA/HAP层在PBS与Ⅱ型胶原酶环境中均降解更慢。整体上，这些结果说明两层在硬度、含水性和稳定性方面形成与天然骨软骨界面相呼应的性能差异。

在“KGN release behavior from the hydrogel scaffolds”部分，论文重点比较了KGN直接负载与脂质体包载后的释药行为。结果显示，GelMA/KGN水凝胶在21 d累计释放约59.91%，而GelMA/KGN@Lip水凝胶在21 d仅释放44.52%，28 d约46.09%。这一结果表明，脂质体与GelMA网络形成双重扩散屏障，可显著延缓KGN释放。研究指出，这种较缓慢的释放动力学有利于在软骨再生早期持续提供成软骨生化刺激。

在“Evaluation of the in vitro biocompatibility of BMSC by hydrogel”部分，研究人员证实各类材料提取液均具有良好细胞相容性。CCK-8结果显示24、72、120 h各组细胞活率均高于100%；活/死染色中绿色活细胞占主导，红色死细胞极少；细胞骨架染色显示BMSCs形态逐渐伸展、F-actin排列更加明显。尤其是GelMA/HAP与GelMA/KGN@Lip组，细胞分布更均匀、覆盖更致密，提示两类功能组分未引入明显毒性，并可能进一步支持细胞增殖与黏附。

在“Evaluation of the osteogenic performance of hydrogels”部分，研究主要证明下层GelMA/HAP具有突出的成骨诱导能力。ALP染色与活性检测显示，第7天GelMA/HAP组表现最强，ALP活性达868.80 ± 15.53 U per mg protein。第21天茜素红S染色显示其矿化结节形成最为显著，定量吸光度为1.9934 ± 0.043。qRT-PCR结果进一步显示RUNX2、Col-I和OCN表达分别上调约1.686 ± 0.06倍、1.720 ± 0.02倍和1.918 ± 0.06倍。由此可见，HAP相关离子释放有效促进了BMSCs由早期成骨启动向后期矿化成熟推进。

在“Evaluation of chondrogenic properties of hydrogels”部分，研究人员证明上层GelMA/KGN@Lip能够显著促进成软骨分化。阿利新蓝（Alcian blue）染色显示，GelMA/KGN@Lip组基质沉积最强且分布最广；糖胺聚糖（GAG，glycosaminoglycan）定量结果也显示该组含量最高。基因层面，SOX9、Col2a1与Acan在GelMA/KGN@Lip组中分别达到1.77 ± 0.01倍、1.76 ± 0.04倍和1.80 ± 0.01倍的最高表达水平。上述结果表明，KGN@Lip通过持续释放KGN，有效激活了BMSCs的成软骨转录程序及软骨特异性细胞外基质合成。

在“In vivo evaluation of osteochondral repair at 6 weeks”部分，研究人员在兔股骨滑车缺损模型中比较了对照组、GelMA/KGN@Lip单层组、GelMA/HAP单层组及双层KGN@Lip//HAP-GelMA组。大体观察显示，对照组缺损明显凹陷，组织长入有限；双层组则呈现更平整表面和更好的周围组织整合。micro-CT显示双层组在软骨下骨界面重建方面最为显著。定量分析中，双层组BV/TV、BMD及骨小梁参数均最高。H&E染色进一步证实，双层组形成了更有组织性的骨软骨修复结构，软骨细胞排列也较单层组更规则，说明该分层设计有助于早期协调性修复。

在“Extended in vivo evaluation of cartilage regeneration at 10 weeks”部分，研究聚焦长期软骨修复。H&E显示双层组几乎实现缺损完全填充，表面最平滑，组织完整性最佳。Alcian blue染色显示双层组软骨样基质积累最丰富；PAS染色结果提示其再生组织厚度与成熟度更接近天然软骨。聚集蛋白聚糖（Acan）免疫荧光亦在双层组达到最强信号，说明其在软骨基质形成与成熟方面具有最优表现。

在“Extended in vivo evaluation of subchondral bone remodeling at 10 weeks”部分，论文进一步说明双层组在软骨下骨重塑上的优势。Masson染色显示双层组缺损填充最完整，软骨下骨结构最致密规则，且与宿主骨整合最好。Col I免疫组织化学、Col III免疫荧光及OCN免疫荧光均显示双层组信号最强，且分布更连续，说明其骨基质沉积和成熟程度最优。这些结果共同表明，将上层成软骨微环境与下层成骨微环境进行空间耦合，较单一层状支架更有利于骨软骨一体化再生。

讨论部分的核心在于，单独的GelMA/KGN@Lip支架虽能改善软骨相关修复，但由于缺乏无机成骨成分，对软骨下骨再生支持有限；单独的GelMA/HAP支架虽能促进骨形成，却难以充分恢复软骨表面连续性及上层软骨组织成熟。相比之下，双层KGN@Lip//HAP-GelMA支架将两种互补功能整合于同一空间构型中，同时结合径向互联通道带来的结构导向作用，从而在组织填充均一性、界面连续性以及软骨与骨的协同再生方面表现更佳。论文据此强调，力学梯度设计、局部生化线索与各向异性结构引导三者协同，是实现功能性骨软骨修复的重要机制。

研究结论部分可译为：本研究构建了一种具有径向取向结构的3D打印双层水凝胶支架，用于模拟骨软骨组织的层级化结构。与传统浇铸方法相比，3D打印能够一步法精确制造复杂的径向取向微通道，无需复杂脱模过程，并具备患者特异性定制的灵活性。通过整合GelMA/HAP层与GelMA/KGN@Lip层，该构建体提供了空间区分的生化微环境。体内结果表明，下层可促进显著的骨形成与基质矿化，这可能与HAP提供的机械支撑及Ca²⁺和PO₄^3?释放有关；相反，上层则支持类软骨组织形成与基质沉积，其中脂质体包封实现了KGN持续释放，以维持成软骨信号。值得注意的是，径向取向微通道似乎有助于增强营养扩散并引导内源性细胞迁移，从而促进更加均一的组织填充和更有序的界面整合。机械梯度设计、局部生化线索和各向异性结构引导的结合，使骨与软骨区域能够实现协调修复。尽管该支架为骨软骨缺损修复提供了有前景的平台，仍需进一步研究以增强并全面评估其力学性能，包括与天然组织相比的压缩模量和界面强度。