《Transboundary and Emerging Diseases》：First Report of Human Infection Caused by Aspergillus steynii and Analysis of Its Whole-Genome Characteristics
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近年来，由罕见病原体引起的感染发病率不断上升，这 necessitates 开发有效的诊断和治疗方法。在本研究中，研究人员报道了首例由斯泰尼氏曲霉（Aspergillus steynii, A. steynii）引起的人类肺部感染病例，并评估了该真菌的形态学和
近年来，由罕见病原体引起的感染发病率不断上升，这 necessitates 开发有效的诊断和治疗方法。在本研究中，研究人员报道了首例由斯泰尼氏曲霉（Aspergillus steynii, A. steynii）引起的人类肺部感染病例，并评估了该真菌的形态学和分子特征以阐明其在人类感染中的作用。一名47岁女性患者，因骨髓移植后处于免疫抑制状态，出现肺部感染症状。通过培养技术、显微镜检查、质谱分析、多基因分子鉴定及全基因组测序，将该病原体鉴定为A. steynii。研究人员进行了抗真菌药物敏感性测试，并开展了比较基因组分析以评估A. steynii与其他致病性曲霉属物种之间的系统发育关系和基因组特征。基因组分析显示，A. steynii与其他致病性曲霉属物种具有高度相似性。此外，研究人员鉴定出470个独特的基因家族，主要与ATP结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter, ABC transporter）通路相关，该通路与多药耐药（multidrug resistance, MDR）相关。该菌株对三唑类（triazoles）和棘白菌素类（echinocandins）药物敏感，但对两性霉素B（amphotericin B）、氟胞嘧啶（flucytosine, 5-FC）和氟康唑（fluconazole）表现出较高的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations, MICs）。此外，研究人员还鉴定出多个潜在的药物耐药基因，表明该菌株具有多药耐药的潜力。A. steynii在人类中的出现带来了新的临床挑战和风险，包括跨物种传播和多药耐药。A. steynii感染的潜在风险，特别是在免疫抑制患者中，凸显了早期诊断和及时干预的重要性，以降低误诊或延迟治疗的风险。因此，该研究发现有助于改善该感染的临床和鉴别诊断，并促进有效治疗方法的开发。
曲霉属斯泰尼氏曲霉（Aspergillus steynii）作为一种新型罕见病原体，首次被发现可导致人类肺部感染，该研究发表于《Transboundary and Emerging Diseases》。近年来，由罕见病原体引起的感染发病率持续上升，这与人类社交行为的影响、气候变化的选择压力以及环境退化等因素密切相关。罕见病原体感染往往难以通过传统诊断工具检测和识别，导致漏诊、治疗延迟、严重并发症甚至死亡。在真菌感染领域，新型真菌病原体的出现对临床医学构成重大挑战，尤其在免疫功能低下个体中常导致严重临床症状。曲霉属（Aspergillus）包含多种致病性和非致病性物种，是引起人类感染较为常见的病原菌。随着侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis）病例的大幅增加，曲霉属相关感染已成为临床微生物学和传染病研究的新兴焦点。传统上，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是最常见的致病物种，其次为黄曲霉（Aspergillus flavus）和土曲霉（Aspergillus terreus）。然而，非烟曲霉（non-fumigatus aspergilli）往往被忽视，增加了临床诊断的难度。
A. steynii此前主要被认为是农业物种，与特定食品 commodities 中赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）的污染相关，包括咖啡豆、大米和发酵饮料等，其分布具有气候偏好性，主要从热带和亚热带地区分离获得。在本病例之前，A. steynii从未有感染人类的报道。该研究报道的病例为一名47岁女性农民，因急性粒细胞白血病接受异基因造血干细胞移植术后7个月，处于免疫抑制状态，出现进行性呼吸困难。临床检查发现患者外周血白细胞计数正常，但C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和乳酸脱氢酶水平升高，胸部CT显示双肺散在磨玻璃影和结节。这些临床表现提示A. steynii感染可能不会引起外周血白细胞计数的显著升高，而血清半乳甘露聚糖免疫球蛋白G（galactomannan IgG, GM IgG）持续阳性可能指示A. steynii引起的肺部感染。
研究人员开展了全面的临床鉴定和特征分析以阐明该菌株在人类感染中的作用。主要关键技术方法包括：从患者支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）中分离菌株，进行沙氏葡萄糖琼脂培养；通过不同培养基观察菌落形态和显微镜下形态学特征；采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）进行蛋白质鉴定；对内部转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）、钙调蛋白（calmodulin, CaM）和β-微管蛋白（β-tubulin, BenA）保守区域进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增和Sanger测序，并进行系统发育分析；对BALF标本进行宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）；采用酵母One商业化抗真菌药敏板进行抗真菌敏感性测试；通过Illumina NovaSeq平台进行二代测序（next-generation sequencing, NGS）以及PacBio Sequel平台进行单分子实时测序（single-molecule real-time, SMRT）完成全基因组测序；利用OrthoFinder、MAFFT、FastTree等生物信息学软件进行基因家族分析、多序列比对和系统发育树构建；与NCBI数据库中公开发表的30种致病性曲霉属物种基因组进行比较基因组学分析，重点关注致病性、耐药性和环境适应相关基因。
研究结果部分，首先呈现病例描述。患者于2022年9月28日入院，9月29日行BALF真菌培养和mNGS，10月3日mNGS鉴定为A. steynii（944条reads），10月10日培养获得曲霉属。抗真菌药物敏感性测试显示：棘白菌素类药物中，阿尼芬净（anidulafungin）MIC为0.015 μg/mL，米卡芬净（micafungin）MIC为0.008 μg/mL，卡泊芬净（caspofungin）MIC为0.008 μg/mL；三唑类药物中，泊沙康唑（posaconazole）MIC为0.12 μg/mL，伏立康唑（voriconazole）MIC为0.25 μg/mL，伊曲康唑（itraconazole）MIC为0.12 μg/mL；而5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine）MIC >64 μg/mL，氟康唑（fluconazole）MIC >256 μg/mL，两性霉素B（amphotericin B）MIC为8 μg/mL。患者接受伏立康唑联合两性霉素B雾化治疗，后改为泊沙康唑，最终再次使用伏立康唑口服维持治疗5个月，至2023年3月24日复查胸部CT显示磨玻璃影完全吸收。
在SMRT测序、组装和注释方面，菌株基因组与A. steynii匹配度最高（95%一致性），命名为CHSY3131。该菌株属于散囊菌目（Eurotiales）、曲霉科（Aspergillaceae）、曲霉属（Aspergillus）、Circumdati亚属。总基因组长度为42,601,056,466 bp，包含11,836个基因，GC含量为47.24%。
比较基因组学分析显示，CHSY3131与30种临床致病性曲霉属物种相比，与黄曲霉和土曲霉亲缘关系最近。32个样本共享170个基因家族，包含400个共享基因；CHSY3131含有127个独特基因家族。CHSY3131与参比菌株IBT 23096相比，在scaffolds 1、2、5和8中存在染色体重排。四基因组比较分析（CHSY3131、IBT 23096、土曲霉和黄曲霉）显示183个共享基因家族，蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析揭示两个主要簇群：核糖体蛋白和囊泡转运信号通路中的SNARE相互作用。
CHSY3131与参比基因组IBT 23096的比较发现，CHSY3131含有470个独特基因家族，编码41个独特的ABC转运蛋白，而IBT 23096仅有27个。基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析显示这些独特基因家族显著富集于膜转运通路，包括多个唑类药物耐药基因拷贝如mtr、mdrA和MFS2。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析表明这些基因家族在ABC多药转运蛋白通路、碱基切除修复和囊泡转运中的SNARE相互作用通路中显著富集（p < 0.05）。470个独特基因家族的注释显示，ABC转运蛋白通路包含多个唑类耐药相关基因拷贝，如abcC、abcH、abcG、artA、artF、artG和artI；碱基切除修复通路包含来源于人类宿主的DNA糖基化酶基因MBD4。PPI分析鉴定出四个蛋白质富集簇：ABC多药转运蛋白、错配修复和修饰相关基因、囊泡转运中的SNARE相互作用以及核糖体生物合成。
形态学比较方面，CHSY3131、土曲霉和黄曲霉在PDA、SDA和CZA培养基上培养5天后进行比较。A. steynii菌落颜色为白色至黄色，中央质地呈絮状绒毛，具有明显的放射状沟槽，孢子密集产生于菌落中心，反面颜色为浅棕色或灰黄色，与土曲霉相似。显微镜下，A. steynii分生孢子头辐射略大于土曲霉和黄曲霉，分生孢子梗（conidiophores）为双轮生（biseriate），在菌落中心产生密集孢子。土曲霉可通过产生厚壁孢子（aleuroconidia）与其他曲霉属物种区分；黄曲霉的分生孢子梗长度不一、粗糙、有凹坑和刺状突起。
菌株鉴定部分，MALDI-TOF MS未能准确鉴定CHSY3131，错误地将其鉴定为赭曲霉（50%概率）或韦氏曲霉（50%概率）。分子生物学技术方面，ITS测序无法区分A. steynii、土曲霉和黄曲霉；CaM测序可区分A. steynii与土曲霉和黄曲霉，但无法区分A. steynii与A. elegans；仅BenA测序可有效鉴定A. steynii。
讨论部分，研究人员强调这是首次报道A. steynii引起的人类感染病例。该患者具有多重感染危险因素：农民职业（暴露于腐烂作物）、异基因造血干细胞移植术后7个月、接受常规化疗、免疫抑制状态。A. steynii此前仅见于农业食品安全领域，无人类感染先例。临床实验室方法容易导致误诊：质谱可误鉴定为赭曲霉或韦氏曲霉；ITS测序无法区分A. steynii、土曲霉和黄曲霉；CaM测序无法区分A. steynii与A. elegans。虽然BenA测序和mNGS可准确鉴定，但由于缺乏对其人类感染潜力的认识，仍存在误诊或延迟诊断的风险。研究人员建议通过特征性菌落形态（赭黄色色素沉着伴颗粒状质地）和显微镜特征（辐射状分生孢子头）进行初步筛查，若质谱鉴定为赭曲霉，应进一步鉴别区分，确诊需要BenA基因测序作为金标准诊断方法。
此外，A. steynii作为常见作物污染物可产生赭曲霉毒素A，该毒素具有肾毒性、肝毒性、致畸性、神经毒性和基因毒性，且具有致癌性。尽管目前尚不清楚A. steynii能否在感染人体宿主时产生OTA并引发毒性反应，但这种可能性引发了对感染后器官损伤潜在风险的担忧。
基因组比较分析显示，CHSY3131与植物源性IBT 23096相比，在scaffolds 1、2、5和8存在染色体重排，与临床常见的黄曲霉和土曲霉亲缘关系密切。这些结果提示在进化过程中发生了多次断裂或融合事件，使A. steynii从原有植物病原体逐渐获得感染人类的能力。470个独特基因家族的扩张可能促进病原真菌进化，最终赋予其在人类宿主中存活的能力。ABC转运蛋白在真菌中已知介导药物外排和次级代谢产物分泌，CHSY3131编码的ABC转运蛋白数量多于植物相关菌株IBT 23096。CHSY3131特异性基因包括多个唑类耐药基因拷贝，如mtr、mdrA和MFS2。虽然药敏测试显示对三唑类和棘白菌素类药物MIC值较低，且cyp51A和FKS基因（fks1/fks2）与烟曲霉比对未发现经典的三唑类耐药突变（如TR34/L98H）或棘白菌素类耐药突变（如FKS1 S678P），但伏立康唑可快速诱导曲霉属ABC转运蛋白表达上调，提示CHSY3131在抗真菌治疗过程中存在获得性耐药的固有风险。值得注意的是，该患者需要长达5个月的治疗才实现显著影像学改善，远长于常见曲霉属物种的常规治疗疗程（通常6–12周），也超过文献报道的完全影像学缓解平均时间线（平均80天）。这种异常延长的治疗病程可能提示：（1）治疗期间MIC在常规耐药阈值以下进行性升高；或（2）药物选择压力下ABC转运蛋白系统部分激活，导致疗效降低。因此，研究人员强烈建议对A. steynii感染加强真菌学监测，包括序贯真菌鉴定和抗真菌药物敏感性测试，特别关注治疗过程中伏立康唑耐药的发展。
CHSY3131对5-氟胞嘧啶、氟康唑和两性霉素B表现出高MIC，且与土曲霉和黄曲霉具有遗传相似性，后两者也对两性霉素B有较高MIC。异常过氧化氢酶表达与土曲霉对两性霉素B的固有抗药性相关，研究人员推测过氧化氢酶可能也参与了A. steynii中两性霉素B高MIC的产生。综上，A. steynii可能在感染过程中对三唑类和棘白菌素类药物发展出高MIC，定位为潜在的新兴多药耐药真菌病原体，类似于耳念珠菌（Candida auris）。
研究人员还关注到跨物种传播和耐药性获得的问题。气候变化是全球性关切，欧洲平均气温上升3–5℃，伴随干旱、降雨、洪水和作物生长周期变化，亚洲和美洲其他作物种植区也观察到类似变化。这些更温暖的气候可能增加环境真菌成为临床病原体的潜力。农业杀菌剂，特别是作物生产中常用的唑类，可在环境曲霉属物种中诱导耐药突变，导致对医用三唑类的交叉耐药。因此，研究人员建议农业和卫生主管部门密切监测农业工人的真菌感染和耐药情况，特别关注其免疫状态，以预防类似本研究的感染发生。
研究结论部分指出，据研究人员所知，这是首次报道A. steynii引起的人类肺部感染病例，特别是一名免疫抑制患者。研究人员采用培养、形态学观察、分子生物学分析和全基因组测序相结合的方法对该病原体进行了全面评估。研究结果强调了在临床环境中了解该菌株的重要性，尤其对于具有作物暴露和免疫抑制等危险因素的患者。临床医生应考虑这些A. steynii感染危险因素，并在鉴别诊断中保持警惕，以避免误诊或漏诊。研究人员还建议密切监测该真菌的感染动态，因为它对临床实践提出了显著挑战，包括感染率上升、疾病严重程度、病程延长以及多药耐药的潜在风险。
