拟除虫菊酯混合物中I型样向II型样症状的协同转变及其对家蝇击倒-死亡关系的影响

《Pest Management Science》：Synergistic transition from type-I-like to type-II-like symptomology in a pyrethroid mixture and its impact on knockdown–mortality relationships in Musca domesticaL

　　

击倒效应，尤其在以拟除虫菊酯（Pyrethroid）为基础的家用及公共卫生杀虫剂中，常被视为杀虫效果的实用指标。然而，更快的击倒是否意味着致死性仍不确定，因为这两种效应之间的关系尚未得到系统探究。本研究以家蝇（Musca domestica）为对象，检验了击倒速度是否与I型拟除虫菊酯（Type-I pyrethroid）、II型拟除虫菊酯（Type-II pyrethroid）及有机磷（Organophosphate）杀虫剂的致死效应存在关联。

对于I型拟除虫菊酯，更快的击倒并不能预测更高的死亡率。早期击倒未必导致致死性，且LD₂₀、LD₅₀和LD₈₀处理组之间未观察到显著差异。相比之下，II型拟除虫菊酯和有机磷杀虫剂表现出正向的击倒-死亡关系，大多数致死个体在早期即被击倒。在混合物研究中，d-苯醚菊酯（d-phenothrin）与丙炔菊酯（prallethrin）表现为相加作用（additive interaction），但与胺菊酯（tetramethrin）则表现为协同作用（synergistic interaction），尽管这三种化合物均为I型拟除虫菊酯。基于卷积神经网络（Convolutional Neural Network, CNN）的计算机视觉症状学分析揭示，在协同性的d-苯醚菊酯与胺菊酯混合物中，中毒表型发生了从I型样向II型样症状的协同转变。

击倒速度不应作为I型拟除虫菊酯致死性的替代指标，这凸显了击倒与死亡之间存在类别依赖性和混合物依赖性的动态关系。这些发现支持将击倒和死亡视为独立性能终点的监管和操作决策，特别是在为农药登记证实"快速杀灭"或"接触即杀"等宣称时。

本研究发表于《Pest Management Science》，旨在阐明杀虫剂击倒速度与致死性之间的关系，特别是针对家用和公共卫生杀虫剂中广泛使用的拟除虫菊酯和有机磷类化合物。

**研究背景与问题**

击倒效应，即昆虫被快速麻痹 incapacitated 的现象，在害虫防治中具有重要实践意义，既能减少害虫逃离处理区域的机会，又能向使用者提供即时的效果确认。美国环境保护署（U.S. EPA）在40 CFR 156.10(a)(5)条款下，允许基于特定短时间间隔（如30秒）内测得的击倒率来证实"击倒"、"快速杀灭"或"接触即杀"等标签宣称。然而，快速击倒尤其是与拟除虫菊酯相关的击倒，并不总是导致死亡，被击倒的昆虫经常能够恢复，表明快速击倒未必保证致死性。先前研究在化合物水平上比较了击倒效力与毒性之间的关系，但主要关注化合物的开发阶段，而非终端产品的实际应用。更为关键的是，在个体变异水平上，即被相同剂量杀虫剂处理的个体之间击倒速度存在显著差异的情况下，更快被击倒的个体是否更易死亡，这一实际且关键的问题此前尚未得到系统研究。此外，击倒并非均质现象，而是包含痉挛、震颤、过度活动、活动低下、共济失调、俯卧、麻痹和定向障碍等一系列动态症状，但以往研究多依赖简单的观察性描述，缺乏定量测量和标准化标准。因此，建立定量化的症状学方法对于昆虫毒理学研究具有重要意义。

**研究设计与主要结论**

研究人员以家蝇（Musca domestica）为模型生物，首先评估了七种单个杀虫剂的急性毒性，包括四种I型拟除虫菊酯（氯菊酯 permethrin、d-苯醚菊酯、丙炔菊酯、胺菊酯）、两种II型拟除虫菊酯（λ-氯氟氰菊酯 λ-cyhalothrin、α-氯氰菊酯 α-cypermethrin）以及两种有机磷杀虫剂（毒死蜱 chlorpyrifos、敌敌畏 dichlorvos）。随后，在LD₂₀、LD₅₀和LD₈₀剂量水平上进行个体水平的击倒-死亡关系分析，并检测了两种商业常用的I型拟除虫菊酯二元混合物（d-苯醚菊酯+丙炔菊酯，1.00:0.77 w/w；d-苯醚菊酯+胺菊酯，1.00:1.80 w/w）的毒性效应。研究还应用基于CNN的定量症状学框架，通过非侵入性自动检测和追踪昆虫身体部位，量化中毒症状的行为特征。

研究得出以下核心结论：第一，杀虫剂类别显著影响击倒-死亡关系，I型拟除虫菊酯中更快的击倒不能预测更高的个体死亡率，而II型拟除虫菊酯和有机磷杀虫剂则呈现显著的正向击倒-死亡关系。第二，两种I型拟除虫菊酯混合物表现出不同的相互作用模式：d-苯醚菊酯与丙炔菊酯的混合物呈现相加效应，而d-苯醚菊酯与胺菊酯的混合物则表现出显著的协同效应。第三，症状学分析揭示，尽管d-苯醚菊酯与胺菊酯混合物仅含I型拟除虫菊酯，但其行为表型发生了从I型样向II型样症状的协同转变，特别是在中毒后期，症状特征与II型拟除虫菊酯极为相似。这些发现具有重要的监管意义，表明不能将击倒速度作为I型拟除虫菊酯致死性的替代指标，支持将击倒和死亡视为独立的性能终点，以确保农药标签宣称的准确性。

**关键技术方法**

研究采用的技术方法主要包括：（1）对韩国疾病管理预防机构（KDCA）来源的易感家蝇品系进行标准化饲养；（2）采用微量点滴法（Topical application）进行杀虫剂处理，使用Hamilton微量注射器配合重复分配器将1.5 μL丙酮溶解的杀虫剂溶液点滴于蝇体背板；（3）基于广义线性混合模型（Generalized linear mixed model）配合负二项分布分析击倒-死亡关系；（4）依据Loewe剂量加和原理计算协同比（Synergistic Ratio, SR），并辅以等效线图（Isobologram）可视化相互作用；（5）运用ResNet101架构的卷积神经网络结合DeepLabCut 3.0软件进行身体部位检测，从4K视频（20-30 fps）中提取9个身体部位坐标；（6）基于坐标数据计算10类行为特征指标（头-胸倾斜、胸-肛曲率、腿部活动、运动、旋转、定向障碍、惊厥、震颤、共济失调、俯卧）；（7）利用MATLAB Classification Learner模块训练32种分类算法，以机器学习预测症状学类别。

**研究结果**

**3.1 杀虫剂的剂量-反应关系**

研究测定了七种单个杀虫剂的LD₂₀、LD₅₀和LD₈₀值及其95%置信区间、剂量-反应斜率和拟合统计量。I型拟除虫菊酯的杀虫活性按胺菊酯、丙炔菊酯、d-苯醚菊酯和氯菊酯的顺序排列，但95%置信区间存在重叠。II型拟除虫菊酯中λ-氯氟氰菊酯在各剂量水平的毒性均高于α-氯氰菊酯，但置信区间同样重叠。有机磷杀虫剂中毒死蜱的效力显著高于敌敌畏。

**3.2 单个杀虫剂的击倒-死亡关系**

通过广义线性模型评估固定效应对击倒时间的影响。结果显示，杀虫剂种类和剂量水平在所有类别中均有显著主效应，但存活状态（Survivorship）的主效应仅在I型拟除虫菊酯中不显著（F=0.16, P=0.6903），表明该类击倒时间在存活与死亡个体间无系统性差异。相反，II型拟除虫菊酯（F=370.81, P<0.0001）和有机磷杀虫剂（F=680.62, P<0.0001）中存活状态有极显著主效应。剂量与存活状态的交互作用在I型拟除虫菊酯中不显著（F=0.01, P=0.9877），但在II型拟除虫菊酯和有机磷杀虫剂中均显著。多重比较表明，I型拟除虫菊酯在各LD水平上存活与死亡个体的击倒时间无显著差异；而II型拟除虫菊酯和有机磷杀虫剂在所有剂量水平上，死亡个体均显著快于存活个体被击倒。

**3.3 I型拟除虫菊酯混合物的毒性**

两种二元混合物的剂量-反应分析显示，混合物1（d-苯醚菊酯+丙炔菊酯）的LD₅₀为1.276 μg/昆虫，SR值在LD₂₀、LD₅₀和LD₈₀分别为0.922、1.000和1.076，呈现相加效应。混合物2（d-苯醚菊酯+胺菊酯）的LD₅₀为0.414 μg/昆虫，各剂量水平SR值分别为2.519、2.551和2.564，表明强烈的协同效应。

**3.4 I型拟除虫菊酯混合物的击倒-死亡关系**

混合物整体分析显示，混合物种类、剂量水平和存活状态均有显著主效应。混合物1在各剂量水平上，存活与死亡个体的击倒时间无显著差异，呈现I型拟除虫菊酯样的弱击倒-死亡关联。混合物2则在所有剂量水平上，死亡个体显著快于存活个体被击倒，呈现II型拟除虫菊酯和有机磷杀虫剂样的强击倒-死亡关联。

**3.5 CNN训练与性能**

ResNet101模型在手动标注数据集上进行训练，2100帧来自253个视频，标注9个身体部位。训练后RMSE从4.727像素降至2.788像素，mAP和mAR分别从14.205%和15.901%提升至90.455%和92.010%，验证损失和训练损失分别达到0.00150和0.00144，表明模型收敛良好。

**3.6 跨处理类别的行为变化比较**

Kruskal-Wallis检验及事后比较揭示了不同症状指标的类别差异。（3.6.1）头-胸倾斜：I型和II型拟除虫菊酯的总倾斜均值、中位数显著高于有机磷；I型的标准差和四分位距也显著高于有机磷。（3.6.2）胸-肛曲率：I型和II型的最大曲率显著高于有机磷；I型最小曲率高于有机磷和对照。（3.6.3）腿部活动：I型的前足擦洗比例显著高于对照，平均间隔显著短于其他类别；各肢体峰值运动频率在I型中最高。（3.6.4）运动：I型静止比例低于对照，前向和后向速度各项指标均高于有机磷和对照。（3.6.5）旋转：I型非旋转比例低于II型和对照，顺时针、逆时针和总旋转比例均高于对照；顺时针旋转速度均值在I型和II型中较高。（3.6.6）定向障碍：有机磷的凸包面积、质心距离标准差和最大值显著低于II型和对照。（3.6.7）惊厥：II型的前足和后足惊厥频率显著高于有机磷和对照。（3.6.8）震颤：II型的前足、后足和腹部震颤频率均显著高于对照；I型腹部震颤也高于对照。（3.6.9）共济失调：I型和II型的前足和后足不对称性多数指标显著高于对照。（3.6.10）俯卧：II型的俯卧时间比例和平均俯卧期显著高于对照；有机磷的平均和中位俯卧期也高于对照。

**3.7 症状学模式分类**

**3.7.1 分类算法训练**

在32种分类算法中，子空间判别分析（Subspace discriminant）、二次支持向量机（Quadratic SVM）和粗神经网络（Coarse neural network）表现最优，测试准确率分别为87.5%、81.25%和84.38%。

**3.7.2 混合物的症状学模式**

混合物1被三种模型绝大多数预测为I型拟除虫菊酯（85%-95%）。混合物2则被 predominantly 预测为II型拟除虫菊酯（63.63%-77.27%），仅少量预测为I型（18.18%-31.82%）或有机磷（4.5%）。

**3.7.3 混合物2症状学分类的时间动态**

将混合物2的记录按中位击倒时间分为早期（前36%）和晚期阶段。早期阶段，三种模型主要将其分类为I型拟除虫菊酯（77.27%-86.36%）；晚期阶段则绝大多数分类为II型拟除虫菊酯（86.36%-95.45%），支持了从中毒早期的I型样症状向后期II型样症状转变的假设。

**讨论与结论总结**

讨论部分深入分析了研究发现的多重意义。研究人员指出，击倒速度与死亡率的脱离现象可能与代谢恢复有关：I型拟除虫菊酯通过钠通道调制引起的急性神经兴奋可导致快速击倒，但昆虫若具备足够的代谢能力即可在击倒后解毒恢复。这提示亚致死暴露可能对昆虫抗性管理产生隐患，因为暂时性麻痹但未死亡的个体可能施加选择压力， favor 具备高代谢能力的抗性个体。然而，代谢恢复 alone 无法完全解释观察到的模式，因为II型拟除虫菊酯和有机磷虽经相似酶途径代谢，却呈现正向击倒-死亡关系，推测导致持续或不可逆神经元损伤的化合物更能确保击倒后的致死性。

在混合物研究方面，研究人员强调商业上常将"击倒剂"（如丙炔菊酯或胺菊酯）与"杀灭剂"（如d-苯醚菊酯）配伍，但这种组合未必保证快速击倒与最终死亡的个体一致性。值得注意的是，两种I型拟除虫菊酯混合物表现出截然不同的相互作用模式：d-苯醚菊酯+丙炔菊酯仅呈相加效应，而d-苯醚菊酯+胺菊酯却呈现协同效应，后者还表现出类II型的击倒-死亡关系。

症状学的定量分析是本研究的方法学创新。通过CNN将传统定性描述（如"震颤"或"麻痹"）转化为可量化的行为特征，不仅成功用于高准确率区分杀虫剂类别，还能推断潜在的协同相互作用机制。混合物2虽完全由I型拟除虫菊酯组成，但其症状谱频繁被归类为类II型，且时间序列分析证实存在从早期I型样向晚期II型样症状的明确转变。这一涌现的行为转变提示，协同作用可能不仅反映生物利用度增强（如促进表皮穿透或抑制解毒酶），还可能涉及毒理学动态层面的相互作用。

研究人员也坦诚了研究局限性：仅检测了两种I型拟除虫菊酯混合物，样本量有限；仅使用单一易感家蝇品系，结果向其他品系、物种或作用模式的推广需谨慎；症状学框架依赖二维腹面视角和剪翅处理，可能损失部分行为信息，未来三维姿态估计方法或可改进。

研究结论部分明确指出：本研究首次在个体水平上证实击倒速度与死亡率的关系因杀虫剂类别而异；I型拟除虫菊酯的快速击倒不能一致预测个体死亡，可能导致"快速杀灭"等标签宣称的误读；d-苯醚菊酯与胺菊酯之间存在协同相互作用，表现为毒性增强和击倒-死亡关系的出现；基于CNN的行为分析与分类算法表明，协同效应可能源于协同作用模式而非代谢抑制或表皮渗透增强；研究强调评估个体水平变异对于杀虫剂效力评价的重要性，并提出基于计算机视觉的定量症状学可作为阐明杀虫剂混合物协同机制的有价值工具，该框架还可推广至植物-昆虫互作及引诱剂、驱避剂研究等其他行为相关领域。