等离子体活化水与酚类化合物：对抗酵母菌抗逆性的一种有效联合策略

《Journal of Agriculture and Food Research》：Plasma-Activated Water and Phenolic Compounds: A Potent Combined Strategy Against Yeast Resilience

　　

有效的真菌控制对于防止食品、医疗保健和工业领域的腐败、污染和感染至关重要。本研究探讨了由瞬态火花（transient spark, TS）放电产生的等离子体活化水（plasma-activated water, PAW）与天然酚类生物活性化合物联合作用，对酵母菌酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalous）的浮游生长、生物膜形成和表面黏附的抗真菌活性。在确定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）后，研究人员以1或2 mg/mL的浓度对酚类物质进行了浮游生长测试。生物膜在无菌载玻片上培养48小时，用吖啶橙或荧光增白剂（calcofluor）染色，并在荧光显微镜下观察。研究人员在将自来水进行等离子体处理后立即使用PAW，以制备PAW-酚类溶液。PAW与肉桂酸和香兰素的组合对浮游和生物膜生长以及表面黏附显示出最显著的抗酵母活性。用PAW-酚类组合形成的生物膜明显破碎，残留细胞结构受损。当500 μg/mL的肉桂酸与PAW联合使用时，观察到生物膜形成被完全抑制。研究结果表明，PAW与酚类化合物的联合具有强大潜力，代表了一种预防真菌生长的有效新策略。

**研究背景与问题**
酵母菌（yeasts）在食品生产、生物技术和制药工业中具有重要应用，但失控的真菌生长会导致食品腐败、环境污染和医疗机会性感染。传统的化学杀菌剂和热处理策略因微生物耐药性、环境毒性及对产品品质的负面影响而面临约束，亟需开发可持续、环境友好的抗真菌方法。等离子体活化水（plasma-activated water, PAW）通过瞬态火花（transient spark, TS）放电产生多种活性氧和氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, RONS），可破坏微生物细胞；天然酚类化合物（phenolic compounds）则通过膜脂质扰动、氧化胁迫等机制发挥抗真菌作用。然而，两者联合应用的研究尚属空白。为此，研究人员评估了PAW与四种天然酚类（肉桂酸cinnamic acid、香兰素vanillin、对香豆酸p-coumaric acid、没食子酸gallic acid）的联合抗酵母活性，探讨其对浮游生长、生物膜（biofilm）形成和表面黏附的影响，论文发表在《Journal of Agriculture and Food Research》。

**主要技术方法**
研究人员采用1 kHz TS放电生成PAW，通过UV-Vis吸收光谱结合化学剂量法（钛氧硫酸盐法测H₂O₂、靛蓝三磺酸盐脱色法测O₃、Griess试剂法测NO₂^-、2,6-二甲基苯酚法测NO₃^-、对苯二甲酸荧光法测·OH）测定RONS浓度。采用间接（PAW溶解酚类后加入酵母液）和直接（酵母悬液先经TS放电处理后再加酚类）两种模式处理浮游酵母细胞（菌株：S. cerevisiae SZMC 1279与W. anomalous SZMC 8061Mo，源自菌种保藏中心），通过平板计数评估生长抑制。生物膜形成抑制实验在96孔聚苯乙烯微孔板中进行，以500 μg/mL酚类联合PAW处理48小时，经超声剥离后涂板计数。表面黏附实验采用相同浓度处理4小时后回收黏附细胞。生物膜结构用吖啶橙（acridine orange）或荧光增白剂（calcofluor）染色后于荧光显微镜下观察。

**研究结果**
**3.1 TS放电**：通过电压-电流波形测量，确认TS放电在4 W功率下生成，为PAW提供高密度RONS。
**3.2 PAW分析**：PAW的pH从7.9降至7.5，电导率（electrical conductivity, EC）和总溶解固体（total dissolved solids, TDS）分别增加36 μS/cm和30 ppm，温度仅升高0.8°C，证实其非热特性。RONS中NO₂^-（1327 μM）和NO₃^-（1250 μM）浓度最高，H₂O₂（398 μM）次之，·OH（15 μM）和O₃（6.01 μM）较低，表明TS放电有效富集了氧化性物种。
**3.3 PAW-酚类处理浮游酵母**：间接处理中，PAW-肉桂酸组合在2 mg/mL时对两种酵母均实现>8 log抑制，显著优于单一处理；PAW-香兰素也显示增强活性，而对香豆酸和没食子酸效果较差。直接处理（原位等离子体暴露）进一步增强了PAW-肉桂酸和PAW-香兰素的抑制，其中PAW-肉桂酸在1和2 mg/mL均完全抑制两种酵母生长。UV-Vis光谱显示PAW处理后肉桂酸和香兰素吸收峰变化，提示RONS可能对其进行了氧化修饰。
**3.4 生物膜形成抑制**：500 μg/mL酚类联合PAW时，PAW-肉桂酸完全抑制两种酵母的生物膜形成（>7 log），PAW-香兰素在S. cerevisiae中达7 log抑制，在W. anomalous中为4.3 log抑制，而单独处理效果有限。
**3.5 荧光显微镜分析生物膜**：PAW-肉桂酸处理组生物膜结构严重破碎，细胞形态不规则，出现残留碎片和弥散核酸，表明细胞壁和质膜破坏，再生长实验证实细胞丧失活力。
**3.6 酵母黏附分析**：PAW-肉桂酸对W. anomalous的黏附抑制达6 log，对S. cerevisiae为2.8 log，PAW-香兰素抑制较弱，存在菌株差异，可能归因于细胞壁组成不同（如S. cerevisiae的β-葡聚糖-几丁质基质和糖基化黏附素）。

**讨论与结论**
讨论认为，PAW与酚类的协同作用主要源于PAW产生的RONS破坏酵母细胞膜完整性、诱导氧化应激、干扰胞内氧化还原平衡，同时氧化改性酚类化合物使其活性增强。对生物膜而言，PAW还阻碍胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）的形成和稳定，促进酚类渗透。菌株特异性差异与细胞壁组成密切相关。研究强调选择低抗氧化活性的酚类（如肉桂酸）对最大化联合效应至关重要。直接处理因同时涉及短寿命和长寿命RONS及物理效应而更有效。结论翻译如下：本研究通过将PAW与天然酚类化合物结合，对酿酒酵母（S. cerevisiae）和异常威克汉姆酵母（W. anomalous）的浮游生长、生物膜形成和表面黏附进行了抗真菌活性研究。直接处理中，PAW与1和2 mg/mL肉桂酸联合完全抑制了两种酵母的浮游生长；500 μg/mL肉桂酸与PAW结合则完全阻止了生物膜形成。PAW与酚类结合的效力取决于PAW是否在酵母存在（直接处理）或缺席（间接处理）下产生，直接处理更为有效。酚类化合物的化学性质显著影响抗酵母活性：PAW-肉桂酸活性最高，可能源于其膜渗透能力及PAW驱动的氧化转变；香兰素效果良好，而对香豆酸和没食子酸有限。PAW的主要作用是通过提供RONS破坏酵母细胞膜完整性、影响胞内氧化还原平衡、阻碍生物膜EPS形成和稳定，并诱导酚类氧化变化，从而增强酚类的渗透和抗真菌活性。总之，PAW-酚类组合在实验室条件下显示出强劲增强的抗酵母活性，但需在实际应用中进一步验证其稳定性和有效性。未来研究应阐明特定PAW-酚类组合增强真菌活性的分子机制，以及PAW-RONS对酚类化合物化学性质和功能的影响。