硫代酰胺稳定化神经肽Y型2受体（Neuropeptide Y type 2 receptor, Y2R）拟肽激动剂用于靶向肿瘤成像

《RSC Chemical Biology》：Stabilized thioamide peptide agonists of the neuropeptide Y type 2 receptor for targeted cancer imaging

　　

神经肽Y型2受体（Y2R）在人神经母细胞瘤及胶质母细胞瘤细胞中高表达，且可促进癌细胞生长。为开发有效的胶质母细胞瘤成像探针，可设计基于肽的Y2R激动剂，通过受体介导内吞被细胞内化；然而大多数神经肽半衰期短（＜30分钟），不适合作为成像探针。硫代酰胺取代（thioamide substitution）——一种羰基氧被硫单原子取代的修饰——是增强肽在诊疗及成像中稳定性的有力手段。本研究设计并评估了首例荧光标记环状硫代酰胺肽（HAP1及HAP1-RS33），作为Y2R特异性激动剂及成像剂。研究人员采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）及质谱（mass spectrometry, MS）分析小鼠血清孵育后肽的酶切位点，证实肽稳定性提升。经稳定化的环化硫代肽探针半衰期由约30分钟显著延长至8小时以上，同时维持对Y2R高表达细胞的中等效价与高选择性结合，可实现Y2R阳性神经母细胞瘤细胞的选择性成像。结果表明，靶向特定受体的硫代酰胺稳定化环肽探针在多种生物学或临床应用中具有潜力。

本文解读发表于《RSC Chemical Biology》的研究论文《Stabilized thioamide peptide agonists of the neuropeptide Y type 2 receptor for targeted cancer imaging》。

研究背景

神经肽Y（Neuropeptide Y, NPY）受体属G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors, GPCRs）超家族，含Y₁R、Y₂R、Y₄R、Y₅R及y₆R等亚型。其中Y₂R在胶质母细胞瘤（glioblastoma）及神经母细胞瘤（neuroblastoma）中高表达，且其密度可与乳腺癌中高表达的Y₁R相媲美，是极具潜力的肿瘤成像靶点。天然NPY及肽YY（peptide YY, PYY）虽为Y₂R内源配体，但对Y₁R/Y₂R无选择性，且36肽全长易于被蛋白酶水解，体内半衰期不足30分钟，难以直接用作成像探针。已有研究表明基于NPY C端构建的十二肽环肽cyclic [Lys₂₈-Glu₃₂]NPY_25–36是Y₂R最小全长激动剂；硫代酰胺（thioamide，肽骨架C=O被C=S取代）修饰可阻断激肽释放酶（kallikrein）在精氨酸位点的切割从而提升肽代谢稳定性。本研究在此基础上，将硫代酰胺引入荧光标记的环化NPY拟肽，旨在解决Y₂R靶向肽探针稳定性差的问题，并实现Y₂R高选择性肿瘤细胞成像。

主要关键技术方法

研究人员以NPY C端片段为模板固相合成线性及环化（Lys₂₈–Glu₃₂内酯桥）荧光素（fluorescein via Ahx linker）标记拟肽，并在Arg₃₃位点进行硫代酰胺取代得HAP1-R^S₃₃，对照为全酰胺类似物HAP1。采用小鼠血清孵育结合HPLC及基质辅助激光解吸电离质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）分析肽剩余率及酶切位点以确定半衰期（t_1/2）。使用表达Y₂R的CHO-K1细胞通过β-arrestin报告基因实验测定激动EC₅₀，以表达Y₁R的细胞评价亚型选择性。以Y₂R阳性SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞、Y₁R阳性MCF-7乳腺癌细胞及Y受体阴性的HEK293T细胞为模型，进行共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy）细胞成像及流式细胞术（flow cytometry）测定结合解离常数（K_d），并以未标记NPY作竞争阻断对照验证靶点特异性。

Fluorescently labeled NPY Y₂receptor targeting peptide design and serum stability（荧光标记NPY Y₂R靶向肽设计及血清稳定性）

研究人员先合成了线性（Oxo Linear_24–36、Thio Linear_24–36）及环化（Oxo Cyclic_24–36、Thio Cyclic_24–36）全长NPY_24–36拟肽。血清稳定性实验表明线性肽无论是否硫代酰胺化均于50–70分钟内被降解（t_1/2≈50–70 min），硫代酰胺未能提升整体稳定性因存在非kallikrein多位点切割；单纯环化（Oxo Cyclic_24–36）t_1/2仅约37 min（短于线性），因环化消除Lys₂₈切点后Arg₂₅成为新酶切位点；而环化+Arg₃₃硫代酰胺（Thio Cyclic_24–36）t_1/2延长至6.2 h，较全酰胺肽提升＞10倍，且可抵抗kallikrein在Arg₃₅的切割。鉴于仍存在N端Arg₂₅切点，研究人员删去Arg₂₅得到缩短环肽HAP1（全酰胺）及HAP1-R^S₃₃（Arg₃₃硫代酰胺）。结果显示HAP1 t_1/2≈35 min，HAP1-R^S₃₃t_1/2≈8.4 h，较HAP1提升14倍，主要酶切位点（Arg₃₅）被硫代酰胺阻断。

Evaluation of biological activity（生物活性评价）

以CHO-K1/Y₂R细胞测定钙/β-arrestin通路激活，HAP1的Y₂R激动EC₅₀=271±40 nM，HAP1-R^S₃₃EC₅₀=1994±477 nM，二者均能激活Y₂R；删除Arg₂₅使活性较Oxo Cyclic_24–36（EC₅₀=13±2 nM）下降约21倍，硫代酰胺进一步使HAP1活性下降约7倍，但仍在nM–低μM级可检测范围内。在CHO-K1/Y₁R细胞中，HAP1与HAP1-R^S₃₃均无激动活性（无Y₁R激活），拮抗IC₅₀＞40–50 μM，表明其对Y₂R相对于Y₁R具有高选择性。

Cellular imaging and flow cytometry（细胞成像与流式细胞术）

用荧光素标记HAP1及HAP1-R^S₃₃（250 nM，30 min）孵育细胞：SH-SY5Y（Y₂R+）显示强绿色斑点状胞内荧光，可被预孵育过量未标记NPY竞争性抑制；MCF-7（Y₁R+）及HEK293T（Y受体?）几乎无荧光信号，证明探针结合Y₂R后被受体介导内吞（4°C条件下摄取显著减少）。流式细胞术测得HAP1 K_d=2021±418 nM，HAP1-R^S₃₃K_d=1280±182 nM，硫代酰胺类似物膜结合亲和力略优，二者均特异性结合Y₂R表达细胞。

Conclusions（结论）

研究人员基于已知Y₂R激动环肽Ac-[Lys₂₈-Glu₃₂]NPY_25–36，设计合成了荧光标记环状硫代酰胺肽HAP1及HAP1-R^S₃₃。通过在Arg₃₃位点引入硫代酰胺并结合N端Arg₂₅缺失与环化，使肽在小鼠血清中半衰期提升14倍（达8.4 h）的同时保留对Y₂R的中等激动效价及高Y₂R/Y₁R选择性。细胞实验证实此类探针可通过受体介导内吞选择性成像Y₂R高表达神经母细胞瘤细胞。该硫代酰胺稳定化策略可推广至其他疾病相关受体的荧光/放射性标记环肽探针开发，未来可通过C端残基置换（如Tyr₃₆→p-fluoro-Phe）、人血清稳定性测试及小动物活体（近红外染料替代荧光素）实验进一步优化。