Atg23通过疏水性结合口袋分别结合Atg9的N端和C端

《Journal of Biological Chemistry》：Atg23 interacts with both the N- and C-termini of Atg9 via a hydrophobic binding pocket

　　

巨自噬（macroautophagy）是胞质物质被包裹于双膜囊泡——即自噬体（autophagosome）——中，随后与液泡或溶酶体融合并导致捕获内容物降解的细胞过程。自噬体的生物发生起始于数个含整合膜蛋白Atg9的小囊泡融合。Atg9囊泡运输部分受外周膜蛋白Atg23调控。然而Atg23的结构及其与Atg9相互作用的分子机制尚不清楚。因此，研究人员解析了单体形式Atg23的晶体结构并表征了Atg23与Atg9的相互作用。本工作揭示Atg23含有一个新颖折叠方式，除朝向二聚化区域的螺旋存在弯曲使整体构象比AlphaFold 3预测更弯曲外，与AlphaFold 3预测一致。此外，研究人员证实Atg9无序N端和C端最末端的高度保守序列结合于Atg23表面的疏水空腔（hydrophobic cavity）。这些Atg23结合区域不同于先前鉴定的Atg9无序N端中与Atg11的结合区，表明Atg9无序末端含有多个不同的蛋白互作区域。

论文解读——《Journal of Biological Chemistry》刊载研究：Atg23通过疏水性结合口袋分别结合Atg9的N端和C端

一、研究背景与立题依据

巨自噬（macroautophagy，以下简称自噬）是真核细胞中将胞质 cargo 靶向至液泡（酵母）或溶酶体（高等真核生物）进行降解的重要过程，对发育、稳态维持、营养胁迫响应及免疫等均具关键作用，其功能紊乱与肿瘤、神经退行性疾病等密切相关。自噬体（autophagosome）的生物发生需要核心自噬蛋白机器，其中Atg9是唯一整合膜蛋白，定位于30–50 nm小囊泡（Atg9 vesicles），该囊泡被认为是吞噬泡（phagophore）的初始膜来源。Atg9囊泡的生成与运输除依赖一般囊泡运输因子外，还需自噬特异性外周膜蛋白Atg23和Atg27。Atg23缺失阻止Atg9离开高尔基体，Atg27缺失则影响Atg9回收与循环。既往研究表明Atg23为高度延展的α螺旋二聚体（dimer），可通过膜互作拴系囊泡，且Atg23二聚化缺陷突变体减少Atg9 puncta 及自噬起始位点招募，但全长Atg23的高分辨率三维结构及其与Atg9直接互作的分子机制均未知。为此，研究人员解析了Atg23单体形式的晶体结构，并结合生物物理与生物化学手段阐明Atg23与Atg9无序末端的互作模式。

二、主要关键技术方法

研究人员以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Atg23和Atg9为研究对象，通过AlphaFold 3建模指导设计去除二聚化界面并引入短连接肽（Ala-Asn-Asn-Ser，ANNS）及截去C端无序区的Atg23_ΔNNS（即Atg23_ANNS）单体构建设计；表达纯化野生型及点突变体蛋白（包括硒代甲硫氨酸标记）；采用X射线晶体学（2.1 ?分辨率，空间群P2₁，分子置换/单波长反常衍射法 phased）解析Atg23_ANNS晶体结构；通过尺寸排阻色谱（SEC）、圆二色光谱（CD）、动态光散射（DLS）表征蛋白寡聚态与热稳定性；利用生物膜干涉仪（BLI, biolayer interferometry）和等温滴定量 calorimetry（ITC, isothermal titration calorimetry）测定Atg23与Atg9 N端（Atg9 1–255、1–48等）及C端（Atg9 864–997、940–997等）片段的解离常数（K_d）；通过谷胱甘肽S-转移酶 pull-down（GST-pulldown）验证互作及关键残基功能；借助AlphaFold 3建模预测Atg23–Atg9复合物并采用Cavity Plus Server、PDBePISA分析结合界面。

三、研究结果

（一）The generation of monomeric Atg23_ANNS

基于AlphaFold 3对二聚Atg23建模发现二聚化界面位于中段α4–α5区域（Ser95–Ser212），研究人员删除该区段（96–211 aa）并以四肽ANNS连接Ser95与Ser212，同时去除C端无序区（382–453 aa）获得Atg23_ANNS。该构建体在大肠杆菌中高效表达、可溶且均一，经SEC呈单一尖峰，DLS确认单体分散性良好，CD显示以α螺旋为主，熔点温度（T_m）达55°C，较全长二聚Atg23（43°C）热稳定性更高，适合结晶。

（二）The crystal structure of monomeric Atg23_ANNS

Atg23_ANNS晶体衍射至2.1 ?，解析获得其晶体结构。整体折叠与AlphaFold 3预测相似，但α3和α5相对预测模型向二聚化侧偏移约12°，使整体单体呈现比AlphaFold 3预测更弯曲的构象，提示全长二聚Atg23可能存在铰链区或柔性。α6区电子密度弱，表明该区具较高动态性。Foldseek比对PDB未发现显著相似已知结构，Atg23具新颖折叠。表面分析显示Atg23含两个主要空腔（cavity），其中较大者（cavity 1，体积1161.62 ?³）衬以保守疏水残基，为潜在蛋白互作位点。

（三）Atg23 interacts with the N-terminal disordered region of Atg9

BLI测得Atg23与Atg9 N端片段（1–255 aa）K_d为1.50±0.70 μM，ITC为5.6±1.9 μM。截断pull-down显示Atg9 1–100 aa保留结合能力，Atg9 40–235 aa几乎无结合，Atg9 1–48 aa K_d为1.19±0.04 μM，确定N端关键结合区位于1–48 aa内保守区。AlphaFold 3预测Atg9 16–26形成α螺旋插入Atg23 cavity 1，其中Phe17深入疏水口袋并与Atg23 Leu323、Met340堆积。定点突变实验证实：Atg9 Phe17Glu近完全丧失结合；Atg23疏水口袋残基Leu323Arg、Met340Glu、Ala377Glu严重削弱结合（K_d无法测定），Ala34Glu适度减弱（K_d=11.0±5.10 μM），非口袋取向残基Tyr16Glu影响轻微，证明Atg9 N端通过其保守疏水残基结合Atg23 cavity 1。此结合区不同于已报道Atg11结合PLF motif（163–165/187–189 aa）。

（四）Atg23 interacts with the C-terminal disordered region of Atg9

BLI显示Atg23与Atg9 C端片段（864–997 aa）K_d为0.46±0.13 μM，ITC为0.79±0.12 μM，亲和力高于N端。截断实验表明最C端940–997 aa为主要结合区（K_d=0.37±0.13 μM）。AlphaFold 3预测Atg9 982–997形成α螺旋以平行方式插入同一cavity 1，关键疏水残基Val982占据与N端Phe17相似位置（埋藏表面积115.70 ?），Atg9 Val982Glu突变近完全破坏结合。Atg23疏水口袋突变Leu323Arg、Met340Glu、Ala377Glu同样严重削弱C端结合，而Ala34Glu对C端结合影响甚微（区别于N端），表明N/C端结合区大体重叠但存在细微差异。C端结合区亦独立于Atg11结合motif。

四、讨论与结论总结（翻译研究结论要点）

研究人员报道了单体Atg23_ANNS的晶体结构，其相较AlphaFold 3预测模型因α7区角度差异呈现更弯曲构象，提示全长Atg23二聚体可能具柔性铰链或弯曲架构。α6区动态性高可能为膜结合相关两亲性螺旋。Atg23远端螺旋束形成的大体积疏水空腔（cavity 1）是Atg9 N端和C端无序区共同的主要结合位点；Atg9 N端靠Phe17（位于预测α螺旋内）及C端靠Val982（位于最C端保守段α螺旋内）分别插入该疏水口袋驱动结合，关键疏水残基及Atg23口袋残基Leu323、Met340、Ala377为互作必需。Atg9上Atg23结合区与Atg11结合PLF motif在空间上分离，理论上可同时结合Atg23和Atg11。N端结合区含已报道磷酸化位点Ser19，暗示磷酸化可能调控Atg23–Atg9互作。Atg23（二聚体）与Atg9（三聚体）多价互作可产生亲合力（avidity）驱动的簇集效应，与自噬蛋白互作特征相符。本研究与同期预印本K_d值吻合良好。酵母中尚无明确哺乳动物Atg23同源物，但Adaptor Protein（AP）复合物1/2/4可能在哺乳动物细胞中行使类似ATG9A运输调控功能。综上，本研究首次解析Atg23结构并阐明其通过保守疏水口袋双向结合Atg9无序末端以调控Atg9囊泡运输的分子机制。