MenB 去N-乙酰基聚唾液酸(de-N-acetyl polysialic acid, dPSA)抗体结构与免疫细胞抑制机制

《Journal of Biological Chemistry》：Structure of a MenB de-N-acetyl polysialic acid antibody and mechanism of immune cell inhibition

　　

摘要：B群脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis serogroup B, MenB)荚膜多糖α(2→8)聚唾液酸(polysialic acid, polySia)是抵抗补体介导的溶菌作用和抑制调理吞噬作用的关键毒力因子。单克隆抗体SEAM 3可结合去N-乙酰基聚唾液酸(de-N-acetyl polySia, dPSA)但不结合polySia，却仍能识别带荚膜的MenB，表明MenB荚膜中含有dPSA衍生物。由于SEAM 3还可识别其他病原体及人类癌细胞，研究人员对其生物学功能进行了探究并绘制了SEAM 3表位。研究人员比较了N-乙酰化与去N-乙酰化polySia及神经节苷脂GD3衍生物与白细胞上唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins, Siglecs)的结合情况。Siglec-9对dPSA和去N-乙酰基GD3(de-N-acetyl GD3, dGD3)亲和力较高(KD≈ 2.6–3.1 nM)，高于其对相应N-乙酰化衍生物的亲和力；Siglec-5结合polySia和GD3衍生物亲和力相似且中等(KD≈40–60 nM和7.9 nM)。Siglec-2、-3、-7、-10和-11几乎无结合。与活的表达dPSA的MenB共孵育的T细胞、NK细胞和单核细胞获得了dPSA及细菌蛋白。亲脂性dPSA衍生物还可抑制脂多糖诱导的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分泌IL-1β、IL-6和TNFα。为定位SEAM 3表位，研究人员将人源化SEAM 3 Fab与dPSA衍生物共结晶，解析了1.83 ?分辨率的结构(Rfree=0.230)，几何质量良好。表位由四个残基组成，非还原端为去N-乙酰基残基。上述结果表明dPSA可能通过结合抑制性Siglec受体5和9参与MenB免疫逃逸，并证实SEAM 3可作为研究dPSA生物学及Siglec在MenB致病中作用的结构探针。

论文解读：《Structure of a MenB de-N-acetyl polysialic acid antibody and mechanism of immune cell inhibition》——发表于《Journal of Biological Chemistry》

B群脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis serogroup B, MenB)的荚膜多糖为α(2→8)连接的聚唾液酸(polysialic acid, polySia)，其与人类胚胎发育中产生的polySia结构相同，因此在人体内引起免疫耐受而难以产生保护性抗体。Jennings等人通过对MenB PS进行去N-乙酰化后再以丙酰基重新酰化(NPr-MenB PS)制备结合疫苗，可打破耐受并产生具血清杀菌活性(Serum Bactericidal Activity, SBA)的抗体。研究中发现部分单克隆抗体(mAbs)能结合MenB及NPr-MenB PS却不结合天然polySia，进一步鉴定这些抗体特异性针对去N-乙酰基聚唾液酸(de-N-acetyl polysialic acid, dPSA)——即疫苗制备中因再酰化不完全产生的副产物。单克隆抗体SEAM 2和SEAM 3可特异结合dPSA，且能识别MenB、利什曼原虫及多种人肿瘤细胞表面dPSA，提示dPSA可能具有广泛的生物学意义。然而dPSA是否被天然存在于MenB荚膜中、其如何被免疫系统感知、以及其是否与MenB的免疫逃逸有关均不清楚。此外，SEAM 3所识别的确切表位结构亦未明确。本研究旨在探明：(1)dPSA是否可被免疫细胞表面的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)识别及哪些Siglec参与；(2)MenB荚膜dPSA能否转移至免疫细胞并影响免疫功能；(3)人源化SEAM 3(huSEAM 3) Fab与dPSA复合物的晶体结构及精确表位。

主要关键技术方法

研究人员采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定重组Fc融合Siglec-2、-3、-5、-7、-9、-10、-11与polySia-ADH、dPSA-ADH及十二胺-dPSA(dodecylamine-dPSA)，以及GD3与dGD3的结合亲和力并计算K_D；以MenB菌株H44/76与人外周血单个核细胞(PBMC)共孵育，激光扫描共聚焦荧光显微镜观察荚膜dPSA及细菌FHbp向免疫细胞的转移；以流式细胞术分析CD3⁺T细胞、CD14⁺单核细胞、CD19⁺B细胞、CD56⁺NK细胞摄取dPSA后SEAM 3平均荧光强度(MFI)变化；以MenB天然外膜囊泡(NOMV)刺激PBMC，检测脂溶性dodecylamine-dPSA及dGD3对IL-1β、IL-6、TNFα分泌的抑制效应；将人源化SEAM 3 Fab与含dPSA四糖的NPr-MenB PS寡糖共纯化后进行X射线晶体学解析(分辨率1.83 ?，PDB 8FPA)。

研究结果

Fc-Siglec receptor binding to de-N-acetyl sialic acid derivatives（Fc-Siglec受体与去N-乙酰基唾液酸衍生物的结合）

通过直接结合ELISA检测发现，Siglec-2、-3、-7、-10、-11不结合polySia-ADH、dPSA-ADH或dodecylamine-dPSA。Siglec-5结合polySia-ADH(K_D=43.6 nM)和dPSA-ADH(K_D=61.1 nM)亲和力相近；Siglec-9结合dPSA-ADH(K_D=2.59 nM)比结合polySia-ADH(K_D=13.2 nM)高约5倍。对人GD3和dGD3的检测显示Siglec-5对两者亲和力相当(K_D≈8 nM)，Siglec-9对dGD3(K_D=3.02 nM)亲和力约为GD3(K_D=7.88 nM)的2倍。人源化SEAM 3(huSEAM 3)高亲和结合dPSA-ADH(K_D=0.64 nM)和dodecylamine-dPSA(K_D=0.81 nM)，不结合polySia-ADH。结论：Siglec-9偏好结合含去N-乙酰基唾液酸的聚糖，Siglec-5对N-乙酰化状态不敏感，SEAM 3特异地高亲和识别dPSA。

dPSA is transferred from MenB bacteria to T cells, monocytes and NK cells（dPSA从MenB细菌转移至T细胞、单核细胞和NK细胞）

共聚焦显微镜显示MenB H44/76与PBMC共孵育后，细菌脂蛋白FHbp(绿色)与dPSA(红色)共同转移至免疫细胞表面并沿膜扩散。流式细胞术分析三位供体PBMC与MenB 8047共孵育30分钟后发现，T细胞(CD3⁺)、单核细胞(CD14⁺)和NK细胞(CD56⁺)的SEAM 3标记MFI分别显著升高63%–174%(平均)，B细胞(CD19⁺)无变化；无关IgG2b同型对照MFI无升高。结论：MenB荚膜中的dPSA及细菌表面蛋白可在菌体与免疫细胞接触时被转移至T细胞、单核细胞和NK细胞表面。

dPSA inhibition of inflammatory cytokine secretion by PBMC（dPSA抑制PBMC炎性细胞因子分泌）

MenB NOMV刺激PBMC后，脂溶性dodecylamine-dPSA剂量依赖性地抑制IL-1β、IL-6和TNFα的分泌，而同样可结合Siglec-5/-9并插入膜的dGD3无此抑制效果；可溶性dPSA无抑制作用。结论：膜锚定的dPSA聚合物可通过与Siglec受体的多价相互作用抑制炎症细胞因子释放，提示其可能参与MenB对免疫反应的抑制。

Crystal structure of humanized SEAM 3 (huSEAM 3) Fab bound to dPSA（人源化SEAM 3 Fab与dPSA结合的晶体结构）

huSEAM 3 Fab与源自NPr-MenB PS制备物的dPSA四糖共结晶，解析至1.83 ?(R_work=0.2048，R_free=0.230)。不对称单位含两个Fab分子(rmsd 0.44 ?)。电子密度显示结合的四糖为：还原端为开链型N-丙酰基(N-Pr)残基1，残基2和3为吡喃糖型N-Pr唾液酸，非还原端残基4为去N-乙酰基唾液酸(de-N-acetyl sialic acid)。残基4的非还原端去N-乙酰基及其正电荷氨基(N5)通过与重链Thr30羟基及周围残基的极性相互作用稳定于结合沟内。结合位点呈净正电荷，埋藏表面积1145 ?²，Fab通过CDR-H1、H2、H3和CDR-L2与四糖形成9个直接氢键及水分子介导作用，重链Tyr残基参与多个接触。四糖骨架二面角不符合polySia螺旋构象。结论：SEAM 3识别以非还原端去N-乙酰基残基为关键特征的四聚dPSA线性表位，结合槽适应伸展寡糖而非螺旋结构。

huSEAM 3 Fab-polySia interactions（huSEAM 3 Fab与polySia的相互作用）

详细分析了Fab各CDR残基(Y33_H1、P31_H1、N53_H2、Y101_H3、G104_H3及轻链N33_L1等)与dPSA四糖各残基氧原子/氮原子的氢键距离(1.9–3.5 ?)，以及残基4上去N-乙酰基的N5与Thr30 OG1的电荷-偶极相互作用(4.8–5.5 ?)。结合界面较抗polySia抗体scFv735更大且直接接触更多，无大量桥接水。结论：SEAM 3通过深裂隙型结合位点以较多直接氢键和较大埋藏面积高亲和结合dPSA四糖，去N-乙酰基是非还原端识别的必要条件。

讨论与结论总结

MenB荚膜多糖中含约50%–70%去N-乙酰基聚唾液酸(dPSA)。本研究发现Siglec-9和Siglec-5可纳米摩尔级亲和结合dPSA，其中Siglec-9对去N-乙酰化形式亲和力显著提高，而Siglec-2、-3、-7、-10、-11不结合。MenB活菌可将dPSA及细菌脂蛋白转移至T细胞、NK细胞和单核细胞表面。膜锚定多价dPSA衍生物可抑制NOMV诱导的促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNFα)分泌，提示dPSA通过结合免疫细胞表面含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的抑制性Siglec-5/-9，促进Siglec聚类及SHP-1/2招募，从而抑制免疫效应功能，协助MenB逃避免疫清除。晶体结构证实SEAM 3表位为四聚α(2→8)连接聚唾液酸，非还原端必须为去N-乙酰基唾液酸，结合位点呈正电性沟槽，与抗polySia抗体不同。研究表明含去N-乙酰基唾液酸的糖链可能在微生物致病及肿瘤免疫调节中发挥比以往认识更广泛的作用；SEAM 3是人源化结构探针可用于dPSA表位及Siglec-9识别特性的研究；MenB荚膜dPSA通过Siglec介导的免疫细胞抑制是一种新型毒力机制，去N-乙酰化酶及dPSA有望成为疫苗或抑制剂的新靶点。