丁型肝炎病毒小抗原(S-HDAg)组蛋白模拟结合BAZ2溴结构域(BRD)的结构洞察

《Journal of Biological Chemistry》：Structural insights into histone mimicry by the small hepatitis delta antigen

　　

： 丁型肝炎病毒(Hepatitis delta virus, HDV)是一种卫星RNA病毒，依赖乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)进行传播但可在细胞核内独立复制其基因组。HDV小抗原(small form of the hepatitis delta antigen, S?HDAg)是病毒复制所必需的，并受翻译后修饰调控。S?HDAg第72位赖氨酸乙酰化(K72ac)使其能与宿主染色质重塑因子BAZ2B(bromodomain adjacent to zinc finger domain protein 2B)的溴结构域(bromodomain, BRD)相互作用以促进病毒复制，然而该互作的结构基础尚不清楚。研究人员通过等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry, ITC)及X射线晶体学解析了该互作，发现BAZ2A?BRD和BAZ2B?BRD均与病毒乙酰化肽呈弱结合，其中BAZ2A?BRD亲和力略高。BAZ2A?BRD–S?HDAg?K72ac复合物的晶体结构显示，病毒肽以相对于经典组蛋白配体反向的结合取向结合于BRD，解释了弱结合现象。定点突变研究在体外及细胞水平验证了关键结合界面。上述结果阐明了HDV通过独特低亲和力互作劫持宿主BAZ2溴结构域的分子机制，为理解HDV复制提供了结构框架。

论文解读：

《Structural insights into histone mimicry by the small hepatitis delta antigen》一文由Haiyun Hu、Mengjiao Lv、Xiaohui Wang、Xinci Shang、Qingyan Wu、Yichang Chen、Yinhao Zhou、Qiuyan Huang、Tao Jiang、Su Qin、Xiaolei Huang、Zhenfeng Zhang、Guoqiang Xu及通讯作者Yanli Liu（苏州大学药学院江苏省脑部疾病药物发现与转化研究重点实验室）完成，发表于《Journal of Biological Chemistry》。

研究背景

HDV是依赖HBV包膜蛋白的最严重嗜肝RNA病毒，其基因组在核内通过双滚环机制独立复制，仅编码大(L?HDAg)和小(S?HDAg)两种抗原，其中S?HDAg对RNA复制至关重要。已有研究表明S?HDAg K72位点发生乙酰化(modification: acetylation at lysine 72, K72ac)后可结合BAZ2B之溴结构域(bromodomain, BRD)，招募ISWI(imitation switch)家族染色质重塑复合物BAZ2B?associated remodeling factor(BRF)以促进HDV RNA复制，但该互作缺乏结构学阐释。BAZ2A与BAZ2B之BRD通常识别组蛋白H3K14ac和H4K16ac所含KacXXR基序(motif)，而S?HDAg含K₇₂acRAR₇₅被推测可模拟此基序，但其真实结合模式及亲和力不明，此为本研究拟解决之科学问题。

主要关键技术方法

研究人员表达并纯化BAZ2A?BRD(残基1796–1899)与BAZ2B?BRD(残基2054–2168)；合成S?HDAg?K72ac(残基67–77)、组蛋白H3K14ac、SNF2L?K814ac及SNF2H?K799ac多肽；采用等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry, ITC)测定结合亲和力；利用X射线晶体学解析BAZ2A?BRD–S?HDAg?K72ac复合物晶体结构(PDB: 23AG)；构建点突变体并通过ITC及HEK293T细胞co?immunoprecipitation(co?IP)验证关键互作残基。

研究结果

The acetylated S?HDAg?K72 peptide binds to the BRDs of BAZ2A and BAZ2B

研究人员在低盐条件(50 mM NaCl)下通过ITC测得S?HDAg?K72ac与BAZ2A?BRD之K_d＝459 μM，与BAZ2B?BRD之K_d＝1066 μM，均为高微摩尔级弱结合，且均弱于组蛋白H3K14ac配体(BAZ2A?BRD K_d＝18 μM；BAZ2B?BRD K_d＝5.6 μM)。BAZ2A?BRD与BAZ2B?BRD亦可结合乙酰化SNF2L/H肽段。热力学分析表明该互作为焓驱动(enthalpy?driven)。序列比对显示两BRD有59.41%相同度及保守二级结构。结论：S?HDAg?K72ac与BAZ2A/B?BRD呈高微摩尔弱亲和结合，BAZ2A?BRD结合稍强。

Structural basis for the recognition of acetylated S?HDAg?K72 by BAZ2A?BRD

研究人员解析了BAZ2A?BRD–S?HDAg?K72ac复合物1.61 ?分辨率晶体结构。S?HDAg?K72ac之K72ac侧链插入由P1817、F1818、V1822、V1827、Y1830、F1872、V1879构成之疏水口袋，并与Y1830、N1873形成氢键或水介导氢键；P69、P70通过骨架羰基与水桥连F1872/E1874并发生疏水堆积。与BAZ2A?BRD–H4K16ac(PDB: 4QBM)及BAZ2B?BRD–H3K14ac(PDB: 4QC1)叠加比较发现S?HDAg?K72ac肽以反向(inverted orientation)结合于BRD乙酰赖氨酸结合口袋，即N→C方向与经典组蛋白肽相反，但关键负电残基E1874/D1875仍对应于识别KacXXR中精氨酸之位置，而S?HDAg之P69占据相当于组蛋白Arg之位点并与I1833发生疏水作用。此反向结合模式合理解释了观测到的弱亲和力。结论：S?HDAg?K72ac以反向取向结合BAZ2A?BRD，体现BRD结合可塑性并导致弱亲和。

Mutation of key interacting residues differentially affects binding

ITC点突变实验表明S?HDAg?K72ac中P69R突变增强与两BRD之结合(BAZ2A?BRD K_d＝162 μM；BAZ2B?BRD K_d＝283 μM)，符合反向结合及KacXXR偏好；R75A突变消除结合。BRD上E1874A/D1875A(BAZ2A)及E2141A/D2142A(BAZ2B)突变显著削弱结合；Y1830A/N1873A(BAZ2A)及Y2097A/N2140A(BAZ2B)突变完全破坏结合，证实乙酰赖氨酸配位残基关键性。细胞co?IP显示FLAG?S?HDAg WT可与HA?BAZ2A/B?BRD共沉淀，P69R增强互作，R75A严重削弱互作，与体外数据一致。结论：关键残基突变验证晶体结构所揭示之反向结合偏好，R75可能参与溶液中间态或双取向平衡。

Mutations in key S?HDAg residues affect its interaction with BAZ2A/B?BRD in cells

HEK293T细胞中co?IP结果确认WT S?HDAg与BAZ2A/B?BRD有效互作，P69R增强，R75A减弱，印证体外发现。研究人员提出S?HDAg通过N端K72ac识别BAZ2A/B?BRD启动招募，C端酸性簇(E125–E129)可能模拟核小体酸性斑(acidic patch)与ISWI复合物ATP酶亚基SNF2L/H相互作用以稳定组装，构成协同双界面模型(synergistic dual?interface model)。此外S?HDAg N端还含核仁蛋白(nucleolin)结合位点(NBS1/NBS2)，表明N端为密集宿主因子互作枢纽(hub)。

讨论与结论翻译

研究人员通过结构生物学与生物物理手段阐明HDV S?HDAg K72ac经非典型弱亲和互作劫持宿主BAZ2染色质重塑因子之分子机制。乙酰化S?HDAg?K72ac肽直接与BAZ2A及BAZ2B之溴结构域(bromodomain, BRD)结合，呈高微摩尔亲和力，BAZ2A?BRD结合略强。BAZ2A?BRD–S?HDAg?K72ac复合物晶体结构揭示病毒肽相对经典组蛋白配体以反向取向结合BRD，直接解释了弱结合现象。突变、生物物理及细胞co?IP实验证实BRD偏好此反向模式，溶液中亦可能存在双取向平衡。上述发现揭示了HDV劫持宿主表观遗传机器的新颖分子策略，拓展了对BAZ2溴结构域家族结合可塑性的认识，为HDV分子病毒学提供重要结构基础，并为后续靶向干预提供框架。