人源Chordin蛋白四个CHRD结构域的结构与生化解构分析揭示其糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)结合新位点

《Journal of Biological Chemistry》：Structural and biophysical analysis of the four CHRD domains of human chordin reveals a novel binding site for glycosaminoglycans

　　

Chordin是一种富含半胱氨酸的蛋白质，作为细胞外基质中骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信号的调节因子发挥作用。Chordin与twisted gastrulation(TWSG1)协同作用，通过紧密结合生长因子来拮抗BMP信号，是建立发育信号梯度相互作用网络的重要组分。已知Chordin通过其四个von-Willebrand factor type C(vWC)结构域与BMP配体相互作用，但中央大片段四个CHRD结构域的功能此前未知。本研究显示这些结构域与硫酸化糖胺聚糖(sulphated glycosaminoglycans, GAGs)强相互作用，并结合X射线晶体学分析、定点突变及生物物理技术确定了结合位点位置。此外，研究人员报道了首个完整功能性Chordin–TWSG1–BMP2–BMP7三元复合物的重组表达与纯化，并用于证明四个CHRD结构域对Chordin拮抗BMP配体的功能基本冗余。因此研究人员提出，Chordin的四个CHRD结构域通过与GAGs或蛋白聚糖(proteoglycans)相互作用，参与Chordin–TWSG1–BMP复合物在组织及机体水平的扩散与定位。

论文解读：人源Chordin蛋白四个CHRD结构域的结构与功能研究

研究背景与意义

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信号通路受多种拮抗剂调控，其中Chordin是通过其N端四个von-Willebrand factor type C(vWC)结构域结合BMP配体、并与twisted gastrulation(TWSG1)形成三元复合物来隔离BMP，从而拮抗BMP受体活化的关键胞外拮抗剂。然而，Chordin蛋白中央约半数质量由四个串联重复的半胱氨酸/组氨酸富集结构域（four cysteine- and histidine-rich domains, 四CHRD结构域或CHRD1–4）组成，该区域在哺乳动物Chordin-like 1/2中缺失，其确切功能长期不明。明确CHRD结构域的作用对理解Chordin–BMP–TWSG1复合物的胞外行为及BMP梯度建立至关重要。本文发表于Journal of Biological Chemistry，研究人员通过解析人源Chordin四CHRD结构域的高分辨率晶体结构，结合生物物理、突变及细胞功能实验，证明其为主要硫酸化糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)尤其是硫酸乙酰肝素(heparan sulphate, HS)/肝素(heparin)结合区，且该区域对BMP拮抗功能非必需，推测其在Chordin–TWSG1–BMP复合物于胞外基质中的锚定与扩散中发挥作用。

主要关键技术方法

研究人员采用Expi293F哺乳动物表达系统重组表达并纯化人源Chordin全长及Δ4CHRD（缺失残基168–657）变体、TWSG1及BMP2/BMP7异二聚体，通过串联Strep-tag与FLAG-tag亲和层析及分子筛获得Chordin–TWSG1–BMP2/7三元穿梭复合物(shuttling complex)；利用X射线晶体学解析四CHRD结构域游离态(apo)、肝素(heparin)寡聚体结合态及关键碱性残基R193A/R239A/R530A/H566A四点突变体的晶体结构；通过小角X射线散射(small-angle X-ray scattering, SAXS/BioSAXS)结合MultiFoXs柔性建模分析溶液中四CHRD组装体的构象动态；采用Carterra LSA^XT表面等离子共振(SPR) GAG芯片阵列及Octet生物膜干涉(biolayer interferometry, BLI)测定四CHRD结构域及全长三元复合物与不同长度/硫酸化度GAG寡聚体的亲和力；通过C2C12成肌细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)诱导抑制实验评估全长与Δ4CHRD Chordin–TWSG1对BMP2/7信号拮抗能力；并以重组BMP1蛋白酶孵育评估四CHRD缺失对Chordin切割的影响。

研究结果

Structure of the four CHRD domains of human chordin（人源Chordin四个CHRD结构域的结构）

研究人员解析了人源Chordin四CHRD结构域（残基168–652）的X射线晶体结构（PDB: 9RD6等），发现四个结构域均折叠为超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase, EC-SOD / SOD3)类似的Greek key β-桶状折叠（含八股β链），但缺失SOD的催化金属结合环，故无SOD酶活性。CHRD1第6股β链Cys235与CHRD2–3间连接肽的Cys403形成链间二硫键，各相邻结构域间存在广泛疏水相互作用及盐桥。电子密度证实Asn351和Asn434存在N-连接糖基化。结构比对显示CHRD3与EC-SOD3契合最佳，但四CHRD整体相对排布不同于EC-SOD四聚体。

Flexibility and dynamics of the four CHRD domain assembly in solution（四CHRD结构域组装体在溶液中的柔性与动力学）

SAXS数据显示四CHRD在溶液中最大尺寸(D_max)约105.7 ?，回转半径(R_g)约29.6 ?。刚性晶体结构拟合差(χ²=42.03)，引入CHRD3与CHRD4间柔性连接子后拟合显著改善(χ²=2.28)，表明CHRD4在溶液中相对CHRD1–3有较大幅度运动，CHRD1–3彼此较为刚性。

The role of the four CHRD domains in inhibition of BMP signalling（四CHRD结构域在BMP信号抑制中的作用）

研究人员共表达获得含全长Chordin或Δ4CHRD变体、TWSG1及BMP2/7异二聚体的三元穿梭复合物。C2C12细胞中BMP2/7诱导碱性磷酸酶(ALP)活性抑制实验显示，全长Chordin–TWSG1与Δ4CHRD–TWSG1对BMP2/7信号抑制能力无显著差异（IC₅₀分别为~6 nM与~4 nM，误差范围内重叠），表明四CHRD结构域对Chordin拮抗BMP配体的功能是基本冗余的。

The role of the four CHRD domains in cleavage of chordin complexes（四CHRD结构域在Chordin复合物切割中的作用）

BMP1蛋白酶切割实验显示全长与Δ4CHRD三元复合物均可被快速初始切割，但Δ4CHRD缺失vWC1下游N端切割位点的切割事件，提示四CHRD可能影响特定位点的可及性，但不影响整体切割速率；外加肝素或DP20不改变BMP1切割速率。

The four CHRD domains as a site for interaction with Glycosaminoglycans（四CHRD结构域是糖胺聚糖相互作用位点）

SPR GAG阵列筛选发现四CHRD结构域及完整Chordin–TWSG1–BMP2/7三元复合物均强结合硫酸化肝素(heparin)、不同长度肝素寡聚体(DP8/DP16/DP24)及硫酸乙酰肝素(heparan sulphate)，不结合硫酸软骨素(chondroitin sulphate)或硫酸皮肤素(dermatan sulphate)，去硫酸化后结合丧失，说明结合依赖GAG硫酸基团高密度及电荷相互作用。

Mapping the glycosaminoglycan binding site（糖胺聚糖结合位点的定位）

通过共结晶获得四CHRD–肝素寡聚体复合物结构（PDB: 9IGM），定位GAG结合位点位于CHRD1与CHRD4之间的强正电荷区域，关键碱性残基包括Arg193、Arg239、Lys600（第一簇）及His562、His564、His566、Lys612（第二簇），可能还涉及His527。另CHRD1表面存在额外正电荷斑区含疾病相关变异Arg276Gln。Alphafold3预测果蝇Sog及爪蟾Chordin中对应残基保守。四点突变体R193A/R239A/R530A/H566A折叠正常（静态光散射T_agg~50.1°C vs 野生型53.1°C），但BLI检测不到明显GAG结合，证实上述残基介导GAG结合。完整三元复合物对DP8(K_D1~6.5 nM, K_D2~24.5 nM)及DP20(K_D1~0.8 nM, K_D2~8.9 nM)具极高亲和力；Δ4CHRD复合物亲和力大幅下降（DP8 K_D1~1568.7 nM），说明四CHRD结构域贡献了Chordin对GAG的主要结合亲和力，vWC结构域及BMP配体本身也提供次要贡献。

讨论与结论总结

研究人员首次解析了人源Chordin四CHRD结构域的实验结构，证实其采用SOD样β-桶折叠但无催化功能，并在CHRD1与CHRD4间形成保守的强碱性GAG结合裂隙，特异性识别硫酸化GAG的磺酸/硫酸根基团。功能实验表明四CHRD结构域对Chordin通过vWC结构域结合并拮抗BMP配体的活性非必需，但提供了Chordin–TWSG1–BMP三元复合物与胞外基质硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulphate proteoglycans, HSPGs)的高亲和力锚定位点。此GAG结合特性在模式生物（果蝇Sog、爪蟾Chordin）中结构及序列保守，提示其在BMP信号梯度建立——即通过GAG介导的复合物胞外基质滞留、扩散或转运——中具有普遍生物学意义。此外，本研究首次报道并建立了全长功能性Chordin–TWSG1–BMP2/7异二聚体三元复合物的哺乳动物重组表达与纯化体系，为后续BMP识别与抑制机制研究及基于BMP拮抗剂的生物治疗开发提供了平台。综上，人Chordin中央四CHRD结构域是一个进化保守的硫酸化GAG结合模块，主要功能为促进Chordin–TWSG1–BMP抑制复合物在胞外基质中的定位与调控性扩散，而非直接参与BMP配体结合与拮抗。