由复合肝素结合基序调控的Erythroferrone对BMPs的拮抗作用

《Journal of Biological Chemistry》：Erythroferrone antagonism of BMPs is governed by a composite heparin-binding motif

　　

铁稳态由骨形态发生蛋白（BMP）信号通路调控，该通路诱导铁调素（hepcidin）负向调节血清铁水平及铁输入。在重大失血事件后，发育中的成红细胞产生erythroferrone（ERFE），其通过抑制肝细胞BMP信号来提高血清铁水平并驱动其向红细胞成熟。尽管ERFE最近被证实含有肝素结合基序（HBM），但其机制意义仍 poorly understood。本研究中，研究人员证实ERFE的HBM对BMP抑制至关重要，并揭示了一种全新的配体拮抗三元机制。利用生物物理检测和分子动力学（MD）模拟，研究人员证实肝素/硫酸乙酰肝素（HS）同时与ERFE和BMP6的HBM结合，以稳定高阶抑制性复合物。该复合物对细胞外基质（ECM）中HS的亲和力远高于ERFE单体，支持其强效的配体依赖性细胞表面定位。重要的是，研究人员证实ERFE优先结合BMP6:HS复合物而非其他BMP配体，提示配体-HS相互作用模式是选择性的关键决定因素。这些发现重新将ERFE定义为一种基质辅助型拮抗剂，其利用HS作为BMP拮抗的结构辅因子，并为ERFE的组织限制性BMP拮抗机制提供了深入认识。

erythroferrone（ERFE）是红细胞来源的铁稳态调节因子，其在失血后由发育中的成红细胞产生，通过上调血清铁水平促进红细胞快速成熟。ERFE从应激性红系造血的骨髓或脾脏迁移至肝脏，抑制BMP依赖的铁调素诱导。值得注意的是，ERFE并不影响机体其他部位的BMP信号，即使在中等程度过表达时亦然，提示存在限制其拮抗作用的分子机制。既往研究虽已鉴定ERFE含有带正电荷的肝素结合基序（HBM）且其缺失可降低BMP抑制活性，但ERFE的HBM及硫酸乙酰肝素（HS）在BMP抑制中的机制角色尚不清楚。发表于《Journal of Biological Chemistry》的此项研究旨在明确ERFE结合肝素/HS的分子基础及其在BMP抑制中的功能作用。

研究人员开展了系统性研究，阐明ERFE通过复合HBM实现BMP拮抗的分子机制。研究发现，HS同时结合ERFE与BMP6的HBM以促进高阶复合物形成，提示HS相互作用可聚类ERFE:BMP6复合物于细胞表面并贡献于ERFE的配体选择性。

本研究所用关键技术方法包括：生物层干涉技术（BLI）用于分析蛋白-肝素相互作用；分子动力学（MD）模拟解析复合物动态结构；分析型超速离心沉降速度法（SV-AUCuvre）鉴定溶液中复合物的生物物理特性；流式细胞术评估细胞表面定位；以及基于BRITER细胞系的荧光素酶报告基因实验量化BMP信号抑制活性。样本来源包括Expi293细胞表达的重组ERFE蛋白、人源BMP6（由Genera Research的Slobodan Vukicevic博士馈赠）以及CHOD-K1野生型与HS N-硫酸转移酶缺陷型细胞系。

**ERFE含有对活性至关重要的肝素结合基序**

研究人员首先验证ERFE的HBM功能。通过比较哺乳动物序列分析，确定位于胶原样重复序列（CLR）与配体结合域（LBD）之间的13氨基酸片段为保守HBM，其共有序列XBBBXBXBXBBXBX符合经典肝素结合共识序列。研究人员构建了突变体：分别替换HBM氨基端或羧基端碱性残基的1st Half*与2nd Half*，以及替换全部8个碱性残基的HBM*。肝素亲和层析显示，野生型（WT）ERFE于800 mM NaCl洗脱，而1st Half*（520 mM）、2nd Half*（541 mM）和HBM*（418 mM）洗脱盐浓度显著降低。BLI检测中，HBM*几乎不结合肝素。功能实验中，BRITER报告基因实验显示HBM*的IC₅₀为133±9.13 nM，较WT（4.16±0.45 nM）降低>35倍，证实HBM本身而非未结合ERFE的肝素亲和力对BMP拮抗至关重要。值得注意的是，CLR*Cys*虽降低肝素亲和力（与1st Half*、2nd Half*类似），却保持完整BMP6抑制活性，进一步支持上述结论。

**ERFE:BMP6复合物较单体组分具有更高硫酸乙酰肝素亲和力**

研究人员提出假说：肝素/HS可同时结合ERFE与BMP6的HBM以稳定抑制复合物。因ERFE:BMP6复合物在中性条件下不溶，直接测量不可行；但添加dp10及以上链长肝素可维持复合物溶解。BLI顺序结合实验显示：先结合BMP6再添加ERFE时，呈现显著增强的结合与极慢解离；而反向顺序（先ERFE后BMP6）则无此协同效应。ΔLBD ERFE缺乏此协同性，证实增强结合依赖ERFE-BMP6直接相互作用。HBM* ERFE的协同结合显著减弱，而CLR*Cys*虽降低肝素亲和力，仍因保留LBD和HBM而显示类似WT的强协同结合。这些结果确立了优先结合顺序：ERFE以更高亲和力 engagement BMP6:肝素复合物。

**计算建模与分子动力学模拟支持HS桥接BMP6与ERFE界面的模型**

研究人员采用AlphaFold 3构建BMP6二聚体与截短ERFE三聚体（含LBD、HBM和CLR）模型。300 ns MD模拟显示，无HS时ERFE与BMP6的HBM因静电排斥而迅速分离（RMSD升高），但LBD:BMP6相互作用及CLR三聚化保持稳定；两个ERFE LBD与BMP6类型I受体位点形成强相互作用（ΔH = -94.4 kcal/mol），第三个LBD与类型II受体位点作用较弱（ΔH = -24.4 kcal/mol）。将dp12高度硫酸化HS（IdoA(2S)-GlcNS(6S)）对接到起始模型后，300 ns模拟中HS通过广泛氢键同时结合ERFE和BMP6的HBM（两个重复中分别为24/19和30/38个氢键），使两者共同定位。MMGBSA（molecular mechanics-generalized Born surface area）每残基能量分解显示，ERFE和BMP6的HBM残基均对HS相互作用焓有贡献，而在缺乏HS的模拟中这些残基对ERFE:BMP6相互作用无贡献。

**ERFE:肝素:BMP6复合物为离散的高分子量组装体**

研究人员利用SV-AUC分析溶液中复合物特性。WT ERFE沉降呈现高摩擦比（f/f₀=2.06），主峰为三聚体（s_20,w=5.23±0.08，表观分子量164 kDa），次峰为六聚体（s_20,w=9.15±0.20，403 kDa）。ERFE:dp12肝素复合物特性类似（f/f₀=2.14，s_20,w=4.82±0.19）。而ERFE:dp12肝素:BMP6复合物则呈现显著降低的摩擦比（f/f₀=1.08）和大幅提高的沉降系数（s_20,w=14.59±0.13，表观分子量299 kDa）。摩擦比低于理想球体（1.2）提示样品微异质性，可能源于不同数量肝素链的结合方向差异导致拟合偏差；沉降系数的显著变化一致支持形成了含多个ERFE三聚体和BMP6二聚体的离散高阶复合物，为生物化学检测中的 avidty 和协同结合提供了结构基础。

**ERFE:BMP6复合物以HS依赖性和配体依赖性方式定位于细胞表面**

为验证复合物对天然HS的高亲和力，研究人员采用CHO-K1细胞及其HS N-硫酸转移酶缺陷型匹配细胞系（pgsE-606）进行流式细胞术。100 nM ERFE单独作用时细胞表面荧光微弱，而添加250 nM BMP6后荧光增强约20倍。过量dp20肝素共孵育完全消除细胞表面结合；HS缺陷细胞系无结合信号。HBM* ERFE几乎不结合WT细胞，虽有微弱配体依赖性增加；CLR*Cys* ERFE单独不结合但与BMP6共存时结合强度等同WT。500 nM高浓度ERFE不能挽救结合缺陷。ΔLBD ERFE无配体依赖性细胞表面定位。这些结果表明ERFE细胞表面结合依赖HSPG和BMP6协同复合物形成，需要ERFE的LBD和HBM共同存在，并非由ERFE固有HS亲和力单独驱动。

**不同电荷分布的配体无法促进ERFE与细胞表面结合**

研究人员进一步探究ERFE配体选择性机制。BMP6的HBM位于配体顶面（远离细胞表面方向），而BMP2/4和GDF5/6/7的对应位置为负电荷区域，BMP2的HBM位于底面（面向细胞表面）。TGF-β、activin A、GDF8、GDF11等不显著结合肝素。流式细胞术显示：BMP2仅诱导微弱ERFE细胞表面定位；GDF5和GDF11的配体依赖性结合更弱。与BMP6相比，三者驱动ERFE细胞表面定位的能力显著缺陷，表明ERFE并非无差别结合肝素结合配体，而是优先靶向BMP6:HS复合物；配体特异性HBM定位和细胞外基质拓扑结构是ERFE选择性和功能性拮抗的关键决定因素。

**讨论与结论**

研究人员论证了ERFE调控BMP信号的独特分子机制。ERFE作为循环拮抗剂需专一抑制肝脏BMP信号；其本身对细胞表面HSPG亲和力低，与更高度硫酸化的肝素形成对比。HS硫酸化具有组织特异性，肝脏硫酸化程度最高且某些区域类似肝素，而肾脏等组织硫酸化不足，这为ERFE的肝脏趋向性提供了解释。ERFE必须靶向class II BMPs以避免 further 脱靶效应，BMP6（及推定的BMP2/6异源二聚体）的HBM邻近复合界面的特性使其成为ERFE主要靶点。作为唯一已知的三聚体TGF-β家族拮抗剂，ERFE在高阶复合物中可能形成含2个ERFE三聚体+3个BMP6二聚体或4个ERFE三聚体+6个BMP6二聚体的终末复合物，其多HS结合位点赋予细胞表面avidty。该复合物随后可能被内吞降解，与其他HSPG紧密关联蛋白类似。

研究人员提出肝脏ERFE调控BMP信号的生物学模型：基础状态下，肝窦内皮细胞感应转铁蛋白结合及非结合铁并产生BMP6；BMP6协同肝细胞表面HSPG上调铁调素，抑制肠道及组织铁输出入血。失血后应激性红细胞生成位点产生ERFE，其迁移至高硫酸化HSPG富集的肝窦周间隙，结合HSPG相关BMP6形成高阶复合物，终末性隔离配物、阻断铁调素诱导，从而提升血清铁水平以支持血红蛋白快速生成和红细胞成熟。

该研究揭示了HS整合于ERFE抑制BMP分子机制中的重要作用，将ERFE定义为"基质辅助型"拮抗剂，解释其狭窄生理学效应足迹。对新型靶向策略的深入理解可能为开发选择性靶向高硫酸化环境（如肝脏）中BMP分子的生物制剂提供新机遇，同时保留其他外周组织的必需BMP功能。