利用秀丽隐杆线虫探究UFMylation（UFM1修饰）在发育、应激抗性及神经功能中的机体水平作用

《Journal of Biological Chemistry》：Exploring the organismal role of UFMylation in development, stress resilience and neurological function in C. elegans

　　

摘要：UFMylation（泛素折叠修饰物1修饰）是一种将泛素折叠修饰物1（ubiquitin-fold modifier 1，UFM1）偶联至底物蛋白的翻译后修饰，可调控核糖体稳态、内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激反应及DNA损伤修复等基础过程。尽管UFMylation级联的失活突变在哺乳动物中致死，但在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中可存活，为在机体水平研究其生理作用提供了独特机会。研究人员发现UFM-1（C. elegans UFM1同源蛋白）的表达从幼虫期到成虫期逐渐升高，主要定位于肠道细胞；其在ER应激和自噬诱导时上调，表明UFM-1与这两条通路相关联。研究人员利用CRISPR/Cas9构建了ufm-1功能缺失突变体，发现UFMylation对寿命、发育和生殖至关重要——突变体性腺功能障碍及不育率增加；ufm-1缺失增强了多种胁迫下的耐受性，这种抗逆性可能源于持续ER应激引发的毒物兴奋效应（hormetic response）。ufm-1缺失选择性激活ER未折叠蛋白反应（unfolded protein response in the ER，UPRER）而非线粒体未折叠蛋白反应（UPRmito）。值得注意的是，ufm-1缺失加剧了肌肉表达淀粉样β（amyloid-β）、α-突触核蛋白（α-synuclein）和多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集蛋白的蛋白酶毒性模型中的蛋白聚集，加速瘫痪并增大聚集体数量和尺寸。此外，突变体运动能力受损，包括出现类似衰老线虫的游泳模式改变，源于年龄依赖性感觉神经元功能障碍加速及结构性神经退行。

论文解读：《利用秀丽隐杆线虫探究UFMylation在发育、应激抗性及神经功能中的机体水平作用》

本研究由Charlotte Sophia Kaiser、Janina Kahl等来自德国明斯特大学整合细胞生物学与生理学研究所的研究人员完成，发表于Journal of Biological Chemistry。UFMylation（泛素折叠修饰物1修饰）是由E1活化酶UBA5（ubiquitin-like modifier activating enzyme 5）、E2结合酶UFC1（UFM1 conjugating enzyme 1）及含E3连接酶UFL1（UFM1 ligating enzyme 1）-UFBP1（UFM1 binding protein 1）-CDK5rap3的复合体催化的类泛素化修饰，可将UFM1（ubiquitin-fold modifier 1）偶联至底物，参与内质网（endoplasmic reticulum，ER）稳态、自噬、转录及DNA损伤修复等过程。人类UFMylation级联组分（如UBA5）双等位基因致病突变可致常染色体隐性小脑性共济失调、早发性脑病等神经发育障碍，且完全缺失UFMylation在小鼠胚胎期致死，限制了对其在完整生物体水平生理功能的解析。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，以下简称C. elegans）中UFMylation核心基因（如uba-5、ufc-1）缺失不致死，是理想在体模型。此前团队已初步表征C. elegansUFMylation级联，但核心修饰物UFM-1本身的机体水平作用尚未明确。本研究旨在构建ufm-1功能缺失突变体，系统解析UFM-1在发育、应激响应、运动行为、神经元完整性及蛋白酶毒性中的角色，为理解UFMylation相关人类疾病提供在体依据。

主要关键技术方法

研究人员选用C. elegansN2野生型及CGC来源转基因品系（含hsp-4::gfp标记ER未折叠蛋白反应UPR_ER、hsp-6::gfp标记线粒体未折叠蛋白反应UPR_mito、泛神经元unc-119::gfp、胆碱能神经元unc-17::gfp及肌肉表达Aβ/α-synuclein/polyQ-Htt聚集模型株CL2006/UA49/EAK103）。通过CRISPR/Cas9介导dpy-10共转化策略构建ufm-1(eva202)功能缺失突变体并经Western blot验证；制备ufm-1p::gfp::ufm-1转基因报告株分析时空表达及胁迫诱导；通过遗传杂交获得双突变体（ufm-1; hsp-4::gfp、ufm-1; hsp-6::gfp、ufm-1; 神经元报告等）；采用寿命/繁殖/发育时序分析、多种胁迫（渗透压/氧化/ER/重金属）存活实验、固体及液体（CeleST软件量化）运动学检测、DiO染料填充评估感觉神经元功能、荧光定量聚集体尺寸/数量及瘫痪率评估蛋白酶毒性；部分实验辅以ufm-1RNAi敲降及ufm-1p::ufm-1回补株验证表型特异性。

研究结果

UFM-1 expression under normal and stress conditions（正常及胁迫条件下UFM-1的表达）

研究人员构建ufm-1p::gfp::ufm-1转基因株，发现L1–L2期肠细胞仅有微弱GFP信号，L3期起肠细胞（尤后肠）胞质、近核区及顶膜侧可见GFP::UFM-1，L4至成虫期信号最强；RNAi敲低ufm-1后信号降低证实特异性。暴露于氯化镉（CdCl₂，诱导氧化及ER应激）、衣霉素（tunicamycin，抑制N-糖基化，激活UPR_ER）、雷帕霉素（rapamycin，诱导自噬及ER-自噬）4小时均显著上调肠道GFP::UFM-1强度；而热激、胡桃醌（juglone）、二硫苏糖醇（DTT）无显著上调，说明UFM-1诱导具胁迫特异性，非广义应激响应。

Phenotypic characterization of ufm-1 loss of function mutation（ufm-1功能缺失突变体的表型表征）

CRISPR/Cas9构建的ufm-1(eva202)纯合突变体确认UFM-1蛋白缺失。与野生型比，突变体平均窝卵数显著降低（184±35 vs 108±42），寿命缩短（Kaplan–Meier检验p<0.0001），72小时可见发育延迟（L3/L4及成虫比例低于野生型）；69%形成双侧性腺臂、20%单侧短缩、11%双侧缺如，伴胚胎发育停滞或延迟，证实ufm-1对线虫生殖输出、寿命及性腺形态发生不可或缺。回补株部分恢复运动、DTT抗性、寿命及发育延迟，但不恢复生殖力（推测因附加染色质阵列在种系中被沉默），确认表型源于ufm-1缺失。

Stress resistance of ufm-1 loss-of-function mutants under heavy metal, osmotic, oxidative and ER stress（重金属、渗透、氧化及ER胁迫下ufm-1缺失突变体的抗性）

ufm-1突变体对400 mM NaCl（渗透）、0.2 mM juglone（氧化）、11 mM DTT或9 mM TCEP（ER/还原胁迫）存活率显著高于野生型，但对3 mg/mL CdCl₂无增强抗性，说明UFMylation选择性调节渗透、氧化及ER稳态相关胁迫通路，缺失引发适应性抗逆。

Assessment of ER- and mitochondrial-unfolded protein response (UPR_ERand UPR_mito)（ER及线粒体未折叠蛋白反应的评估）

将ufm-1(eva202)引入hsp-4::gfp（UPR_ER报告）及hsp-6::gfp（UPR_mito报告）株。ufm-1; hsp-4::gfp荧光强度显著高于对照（p<0.0001），而ufm-1; hsp-6::gfp无变化，证明ufm-1缺失特异地引起组成型ER应激（UPR_ER活化）而不影响线粒体UPR，该组成型UPR_ER可能是突变体对某些外源胁迫耐受增强的机制（毒物兴奋效应）。

Analysis of locomotion in the ufm-1 knockout mutant（ufm-1敲除突变体的运动分析）

ufm-1突变体固体培养基探索率（13% vs 79%板面积）及径向爬行速度（95 μm/min vs 290 μm/min）显著低于野生型，泳动（CeleST分析）示波发起始率降低、体波数增多、体伸展度增大、游速及划水频率下降，但保留基本爬行-游泳转换能力。回补株改善运动缺陷。提示UFM-1为正常神经肌协调及运动输出所需。

Role of UFM-1 in neurodegeneration and proteotoxicity（UFM-1在神经退行及蛋白酶毒性中的作用）

DiO染料填充示年轻成虫感觉神经元摄取无差异，但ufm-1突变体随龄（day 6/9/12）染料摄取面积较野生型更快下降，提示加速的年龄依赖性感觉神经元功能丧失。泛神经元及胆碱能神经元GFP报告株中，ufm-1突变体老化后出现更多轴突膨体（blebbing）、断裂及整体结构退化。在蛋白酶毒性模型中：polyQ-Htt肌肉模型经ufm-1RNAi后聚集体尺寸增大（数量不变）；Aβ模型ufm-1RNAi加速瘫痪；α-synuclein模型ufm-1RNAi聚集体数量增多（尺寸不变）。综上，UFM-1参与维持蛋白酶稳态，缺失加剧聚集倾向蛋白毒性及年龄相关性神经元结构与功能衰退。

讨论部分总结（研究结论翻译）

UFM1级联是细胞稳态的关键调节因子。本研究利用C. elegans首次在机体水平阐明UFMylation在发育、应激抗性及神经肌功能中的作用。ufm-1在线虫中不致死但对正常寿命、生殖及神经肌功能必不可少，呼应人类UFMylation缺陷相关疾病表型。UFM-1主要表达于肠细胞L3期后，受衣霉素、雷帕霉素及镉特异上调。ufm-1缺失致寿命缩短、发育延迟、生殖力下降及性腺畸形；组成型激活UPR_ER赋予对渗透/氧化/ER胁迫的交叉耐受（毒物兴奋效应），但不激活UPR_mito。ufm-1缺失引致运动缺陷、加速年龄依赖性感觉神经元功能丧失及泛神经元/胆碱能神经元结构退行；在Aβ、α-synuclein及polyQ聚集模型中加剧蛋白聚集与瘫痪，表明UFM-1辅助错误折叠蛋白清除或调控其非常规分泌。综上，UFMylation是C. elegans发育、ER稳态、应激适应及神经肌完整性的关键调节者；其保守性使C. elegans成为解析UFMylation相关神经发育及退行性疾病的有价模型，UFMylation级联有望成为蛋白错折及ER应激相关疾病的潜在干预靶点。