《Interdisciplinary Medicine》：Mixed lineage kinase 3 mediates SARS-CoV-2-induced kidney injury via the Hsp70-IL-17A axis
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尽管新冠肺炎(COVID-19)大流行现被认为已结束，但该病毒仍普遍存在，建议定期按时接种疫苗。传统疫苗及基于RNA的疫苗已挽救全球数百万人的生命；然而其长期疗效仍未知。尚未满足的需求是确定能够减轻SARS-CoV-2感染严重程度及相关健康并发症（包括多器官损
尽管新冠肺炎(COVID-19)大流行现被认为已结束，但该病毒仍普遍存在，建议定期按时接种疫苗。传统疫苗及基于RNA的疫苗已挽救全球数百万人的生命；然而其长期疗效仍未知。尚未满足的需求是确定能够减轻SARS-CoV-2感染严重程度及相关健康并发症（包括多器官损伤）的干预措施。包括肿瘤坏死因子(TNF)在内的促炎细胞因子在COVID-19发病机制及进展至多器官衰竭中起关键作用。本研究描述了混合谱系激酶3(MLK3，TNF下游靶点和丝裂原活化蛋白激酶上游调节因子)在SARS-CoV-2诱导肾损伤中的作用。SARS-CoV-2感染的K18-hACE2小鼠及人肾脏中MLK3活性升高，且与肾损伤程度呈正相关。MLK3通过NFATc1转录上调TMPRSS2表达，基因或药理学抑制MLK3可减弱SARS-CoV-2假病毒进入肾细胞。SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合域(Spike-RBD)激活MLK3从而调控IL-17A。热休克蛋白70(Hsp70)与MLK3相互作用，调控Spike-RBD诱导的IL-17A产生及最终的肾细胞凋亡。研究结果表明，MLK3抑制剂可作为伴急性肾损伤(AKI)的COVID-19患者的治疗干预手段。
论文解读：Mixed Lineage Kinase 3介导SARS-CoV-2诱导肾损伤 via Hsp70-IL-17A轴
一、研究背景与目的
COVID-19由SARS-CoV-2引起，除肺部损害外常并发急性肾损伤(AKI)，是院内死亡独立预测因子，但其分子机制未明。细胞因子风暴中TNF等促炎因子激活MAPK通路，混合谱系激酶3(MLK3/MAP3K11)作为MAPK上游调节因子及TNF下游靶点，在炎症与细胞凋亡中发挥重要作用，但其在SARS-CoV-2致肾损伤中的角色尚不清楚。本研究旨在探究MLK3在SARS-CoV-2诱导AKI中的功能、分子机制及作为治疗靶点的潜力。该论文发表于《Interdisciplinary Medicine》。
二、主要关键技术方法
研究人员采用SARS-CoV-2感染K18-hACE2转基因小鼠及野生型(WT)、MLK3?/?小鼠，经rAAV9（重组腺相关病毒9型）肾内转导过表达人ACE2(hACE2)、SARS-CoV-2 Spike-RBD或MLK3；收集COVID-19死者伴急性肾小管坏死(ATN)的人肾组织及非感染对照；建立人近端肾小管上皮细胞系(HK-2、HEK293、ACHN等)、THP-1源巨噬细胞及iPSC来源人肾类器官；运用免疫荧光(IF)、免疫组化(IHC)、Western blot、qPCR、流式细胞术、TUNEL凋亡检测、TMPRSS2启动子报告基因实验、SARS-CoV-2假病毒感染实验、免疫共沉淀(IP)、邻近连接试验(PLA)、体外激酶实验及细胞因子/凋亡蛋白芯片分析；利用COVID-19db平台进行RNA-Seq数据生信分析筛选MLK家族表达及转录因子结合位点。
三、研究结果
1.1 Mixed Lineage Kinase 3 activity is upregulated in SARS-CoV-2-infected K18-hACE2 mice and human kidneys
生物信息学分析及免疫荧光显示SARS-CoV-2感染的人ACE2-293T细胞及K18-hACE2小鼠肾组织中MLK3(MAP3K11)与磷酸化MLK3(p-MLK3)表达显著升高，伴近端小管刷状缘丢失、TUNEL+凋亡细胞增多；COVID-19患者ATN肾组织同样见Spike蛋白、MLK3及p-MLK3上调且定位于近曲小管。rAAV9介导小鼠肾过表达MLK3可诱发类似ATN病理改变及肾损伤分子1(KIM-1)升高。结论：SARS-CoV-2感染上调肾组织MLK3活性并与肾损伤正相关，MLK3过表达本身可致肾损伤表型。
1.2 Mixed Lineage Kinase 3 upregulates TMPRSS2 expression and enhances SARS-CoV-2 pseudovirus cellular entry
MLK3过表达上调HEK293及HK-2细胞中TMPRSS2蛋白及表面表达，敲低MLK3则下调；TMPRSS2启动子报告实验表明MLK3经NFATc1（而非AP-1、Myc或STAT3）转录上调TMPRSS2；NFATc1 siRNA或抑制剂消除MLK3诱导的TMPRSS2上调。MLK3过表达促进SARS-CoV-2假病毒进入肾细胞，MLK3抑制剂URMC-099或联合TMPRSS2抑制剂MM312显著减少假病毒入胞。结论：MLK3通过NFATc1依赖方式上调TMPRSS2促进SARS-CoV-2进入肾细胞。
1.3 SARS-CoV-2 spike glycoprotein receptor-binding domain (Spike-RBD) promotes Mixed Lineage Kinase 3 signaling in kidney cells
SARS-CoV-2假病毒感染或Spike-RBD处理激活ACE2-293T及HK-2细胞中MLK3激酶活性，Co-IP证实Spike-RBD与MLK3直接相互作用；Spike-RBD诱导p-MLK3核转位及下游JNK磷酸化。在无/低ACE2的小鼠肾近曲小管细胞(BU.MPT)中，Spike-RBD经肾损伤分子1(KIM-1/IgV域)结合激活MLK3。rAAV9共转导hACE2+Spike-RBD于小鼠肾上调p-MLK3及p-JNK并致ATN样病变。结论：Spike-RBD直接与MLK3互作激活MLK3-JNK信号，KIM-1可替代ACE2介导该激活。
1.4 MLK3 inhibition mitigates spike-RBD-induced cytokine expression in kidney cells and human kidney organoids
Spike-RBD刺激以MLK3依赖方式诱导肾细胞及人类肾类器官中IL-17A与KIM-1表达；URMC-099或MLK3基因敲除均抑制该诱导。WT小鼠肾转导hACE2+Spike-RBD后IL-17A、KIM-1升高且血清肌酐上升，MLK3?/?小鼠上述改变被削弱。结论：MLK3介导Spike-RBD诱导的IL-17A与KIM-1表达，其缺失或抑制减轻炎症反应与肾功能恶化。
1.5 Mixed Lineage Kinase 3 inhibition mitigates SARS-CoV-2-induced cytopathic effects (CPE) and spike-RBD-induced apoptosis in kidney cells
URMC-099减轻SARS-CoV-2活病毒感染Vero-TMPRSS2及ACE2细胞的细胞病变效应(CPE)；MLK3敲低或URMC-099减少Spike-RBD诱导的Annexin V+/7AAD+肾细胞凋亡。Spike-RBD上调Hsp70(HSPA1A)，该上调被MLK3敲低抑制；MLK3过表达增加Hsp70，且p-MLK3与Hsp70在核内共定位。结论：MLK3参与Spike-RBD诱导的肾细胞凋亡及CPE，部分通过调控Hsp70表达。
1.6 Spike-RBD upregulates the expression of IL-17A via the MLK3-Hsp70 axis and induces apoptosis in kidney cells
SARS-CoV-2感染小鼠肾及人患者肾组织中Hsp70升高并与MLK3互作（PLA及Co-IP验证）。Hsp70 siRNA阻断MLK3过表达介导的IL-17A上调；外源IL-17A激活MLK3磷酸化并促进KIM-1表达及凋亡，该凋亡可被MLK3敲低或URMC-099抑制，也可被IL-17A拮抗剂阻断。结论：Spike-RBD→MLK3↑→Hsp70↑→MLK3-Hsp70复合物→IL-17A↑→IL-17A反馈激活MLK3→肾细胞凋亡，形成正反馈放大环路。
1.7 Loss of MLK3 prevents spike-RBD-induced IL-17A expression in kidney infiltrating macrophages
SARS-CoV-2感染K18-hACE2小鼠肾F4/80+巨噬细胞浸润增加，Spike-RBD激活THP-1源M0巨噬细胞中MLK3；WT小鼠肾转导hACE2+Spike-RBD后M1型(F4/80+CD11c+)巨噬细胞及CD11c+IL-17A+细胞增多，MLK3?/?小鼠此现象被抑制且M2型比例相对升高。结论：MLK3还调控Spike-RBD诱导的肾浸润M1巨噬细胞IL-17A产生及炎性巨噬细胞极化。
四、讨论与结论总结
讨论指出MLK3在SARS-CoV-2感染肾组织中上调，通过NFATc1上调TMPRSS2促进病毒入胞，并通过与Hsp70互作促进IL-17A产生及IL-17A介导的肾细胞凋亡；MLK3还促进肾M1巨噬细胞浸润及IL-17A分泌，放大炎症损伤。MLK3抑制剂URMC-099在体外及小鼠模型中减轻病毒入胞、炎症因子释放及肾小管凋亡，MLK3全局敲除小鼠存活正常且无表型异常，支持其作为COVID-19相关AKI的潜在治疗靶点。
研究结论翻译：研究人员证实MLK3在SARS-CoV-2致病过程中发挥关键作用，MLK3抑制剂URMC-099可通过阻断病毒入胞、降低促炎信号及抑制Spike-RBD介导的IL-17A产生与释放进而减轻肾细胞死亡，有望成为COVID-19合并急性肾损伤的治疗策略。MLK3经NFATc1转录上调TMPRSS2促进病毒进入；Spike-RBD激活MLK3并与Hsp70互作形成MLK3-Hsp70轴诱导IL-17A表达，IL-17A又可激活MLK3放大损伤；此过程亦促进巨噬细胞向肾内募集及M1型IL-17A+巨噬细胞产生。
