用于原位形成植入剂(in situ forming implants, ISFIs)的生物基溶剂(bio-derived solvents)研究——二甲异山梨醇(dimethyl isosorbide, DMI)与γ-戊内酯(γ-valerolactone, GVL)替代N-甲基-2-吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)的评价

《Journal of Controlled Release》：Bio-derived solvents for in situ forming implants

　　

摘要：原位形成植入剂(in situ forming implants, ISFIs)作为微创、长效可注射的局部缓释给药系统，在过去十年备受关注。N-甲基-2-吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)仍是ISFIs最常用的溶剂，但其环境毒性和致畸性促使研究人员寻找替代品。本研究考察了生物基可再生溶剂——二甲异山梨醇(dimethyl isosorbide, DMI)和γ-戊内酯(γ-valerolactone, GVL)作为NMP潜在替代物的可行性。研究人员分别以20、30和40% w/w聚(乳酸-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA; 乳酸/乙醇酸摩尔比1:1, 10 kDa)配制ISFI，含1% w/w亲水性模型药物曙红Y(eosin Y)。对制剂进行流变学行为、可注射性、植入体形态、染料及溶剂释放评价。流变学分析显示溶剂依赖性差异：GVL的流动行为与NMP相当，而DMI黏度显著更高，该趋势与可注射性结果一致。注射后，NMP和DMI基ISFIs形成球形植入体，GVL基ISFIs则产生塌陷不规则结构。体外曙红Y释放研究表明GVL基ISFIs显著降低突释(burst release)，但因聚合物快速固化及塌陷形态缩短扩散路径而总体释放更快。研究人员建立两阶段模型拟合释放曲线并计算平均扩散系数(D)以实现定量比较。为评价体内性能，研究人员用含2.5% w/w睾酮(testosterone, 临床相关疏水性药物)的ISFI在大鼠体内试验，DMI和GVL基ISFIs的睾酮释放与NMP相当，但NMP组总体血浆浓度较低。本研究表明DMI和GVL有望作为ISFIs中NMP的替代溶剂，性能可与传统NMP相媲美。

论文解读：生物基溶剂替代NMP用于原位形成植入剂(in situ forming implants, ISFIs)的研究

研究背景与意义

溶剂交换型原位形成植入剂(in situ forming implants, ISFIs; 亦称原位凝胶植入剂或储库型植入剂)由生物可降解聚合物[通常为聚(乳酸-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)]溶于与水混溶的有机溶剂[典型为N-甲基-2-吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)或二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)]组成，注射至皮下或肌内后溶剂向周围组织扩散、水渗入，引发相转变使聚合物沉淀形成固体药物储库，实现数周至数月缓释。上市产品(Atridox?、Eligard?、Sublocade?、Perseris?)均基于Atrigel?系统(PLGA/NMP)。然而NMP被美国EPA列为致畸与发育毒性物，FDA归为Class II残留溶剂，欧盟REACH法规限制其在消费品中<0.3 wt%，面临逐步淘汰。现有替代溶剂(如三醋酸甘油酯triacetin、苯甲酸苄酯benzyl benzoate)存在水溶性差影响相转变或黏度过高损害可注射性等缺陷。因此，寻找低毒、生物基、具良好PLGA溶解力与可接受可注射性的NMP替代溶剂具有重要监管与工业价值。本研究选用生物衍生绿色溶剂——γ-戊内酯(γ-valerolactone, GVL)、二甲异山梨醇(dimethyl isosorbide, DMI)及二氢左旋葡烯酮(dihydrolevoglucosenone, Cyrene?)进行筛选，最终因Cyrene?黏度过高(14.5 cP)放弃，重点评估GVL与DMI在ISFIs中的理化适应性及体内外性能，并与NMP对照比较。本文发表于《Journal of Controlled Release》。

主要关键技术方法

研究人员通过Hansen溶度参数(Hansen solubility parameters, δ_d, δ_p, δ_h)计算溶剂与PLGA的Hansen距离(R_a)预测热力学相容性；通过MTT法检测NMP/DMI/GVL对NIH 3T3成纤维细胞的剂量依赖性细胞毒性；自行开环聚合(ring opening polymerization, ROP)制备PLGA(LA:GA=1:1, M_n,NMR=10 kDa, D=2.6, T_g=30°C)；配制含1% w/w曙红Y(eosin Y, 亲水模型药)或2.5% w/w睾酮(testosterone, 疏水模型药)的ISFI(PLGA 20/30/40% w/w溶于各溶剂)；采用旋转流变仪测定牛顿流体黏度与振荡频率扫描获取储能模量(G′)与损耗模量(G″)；通过万能材料试验机经23G(或19G/DMI 40%)针头测定动态滑移力(dynamic glide force, DGF)评价可注射性；将ISFI注入0.15% w/w琼脂糖水凝胶模拟皮下组织，固化后取植入体冻干行扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)观察表面与截面形貌；用UV-Vis监测曙红Y体外释放、气相色谱(gas chromatography, GC)定量溶剂释放并建立两阶段球体扩散模型求取扩散系数(D₁, D₂)；Korsmeyer-Peppas模型拟合释放机制；用根霉脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase)加速降解PLGA植入体并以凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography, GPC)追踪分子量衰减；雌性Sprague–Dawley大鼠(n=5/组)皮下注射含睾酮ISFI，LC-MS/MS测定0~30 d血浆睾酮浓度-时间曲线及AUC_0–21。

研究结果

2.1. Solvent selection（溶剂筛选）

GVL、DMI、Cyrene?具生物来源、低危害特征。Hansen参数计算R_a(GVL)< />_a(NMP)< />_a(Cyrene)< />_a(DMI)，预示GVL与PLGA热力学相容性最接近NMP。Cyrene?因黏度过高致处理困难且LD₅₀较低被排除。MTT实验显示三溶剂在测试浓度下细胞代谢活性无显著差异(P>0.05)，且DMI(LD₅₀≈6531 mg/kg)与GVL(LD₅₀≈8800 mg/kg)口服急性毒性高于NMP(≈4150 mg/kg)。结论：GVL与DMI具备作为NMP替代溶剂的安全性与理论溶解优势。

2.2. Influence of solvents on ISFIs（溶剂对ISFI理化性质的影响）

2.2.1. Viscosity and rheological characterisation of ISFI formulations（流变学表征）

所有ISFI呈牛顿流体。GVL基ISFI黏度与NMP基相当；DMI基因本身黏度较高(6.8 cP vs NMP 1.65 cP)，相同PLGA含量下黏度显著更高(P<0.05)，且随PLGA质量分数升高而增大。结论：GVL流变学行为适合替代NMP，DMI在高聚物负载下可能影响加工性。

2.2.2. Dynamic viscoelastic measurement（动态粘弹测量）

振幅扫描确定线性粘弹区(linear viscoelastic region, LVR)后于1%应变频率扫描。低频下G″>G′(类液行为)，高频下G′>G′(类固行为)；20%~30% w/w PLGA出现G′=G″交叉点且随PLGA升高向高频偏移(因G′平台、G″持续升)；40% w/w NMP/DMI配方G″全程主导(无交叉)。结论：ISFI为粘弹性液体，溶剂类型不改变基本粘弹模式但聚合物浓度效应显著。

2.2.3. Injectability（可注射性）

GVL基ISFI经23G针所需动态滑移力(DGF)与NMP无差异；DMI基20% w/w PLGA尚可，30%与40% w/w DGF显著升高(P<0.05)，40% w/w需改用19G针。结论：GVL可注射性与NMP相当，DMI在高浓度时注射阻力大。

2.3. In vitro release studies of ISFIs（体外释放研究）

以曙红Y为模型药，所有配方呈典型双相释放(初期突释+后续扩散控释)。提高PLGA由20→30% w/w显著降低突释(P<0.05)，30→40%无进一步降低。NMP基ISFI突释随PLGA升高由~100%(20%)降至~40%(40%)；DMI相似；GVL基(30%、40% w/w)突释仅~25%(P<0.05)但总释放期短(16 d vs NMP/DMI 27 d)。GC显示GVL 48 h内完全释放(D更大)，NMP/DMI 48 h残留30%~40%。两阶段扩散模型得GVL溶剂D₁、D₂约为NMP/DMI的2~4倍；曙红Y在GVL基ISFI的S₁阶段D₁较小(因快速相转变包裹药物)，S₂阶段D₂较大(因塌陷不规则形态增大比表面积、缩短扩散路径)。Korsmeyer-Peppas拟合：NMP/DMI 40% w/w(n<0.43)为Fick扩散；GVL 40% w/w前48 h为Fick扩散，之后为反常转运(anomalous transport, 0.43

2.4. Structure and topography of ISFIs（ISFI结构与形貌）

注射入琼脂糖后固化，NMP与DMI形成球形植入体，GVL形成扁平不规则植入体。SEM显示三者内部均有富聚合物相与贫聚合物相("气泡")，NMP/DMI残留溶剂多(贫相比例高)，GVL几无残留溶剂(贫相少)。96 h三方孔隙率相当但表面演化不同：NMP初期较光滑(残溶胀)，随时间变多孔；GVL与DMI早期即现孔。结论：溶剂扩散速率决定相分离速度与最终宏观/微观形貌，进而影响释放行为。

2.5. Comparison of solvent performance indicators（溶剂综合性能雷达图评估）

对细胞相容性、黏度、DGF、植入球形度、曙红Y突释(0–20 h)、释放持续时间及突释后线性度打分(0–5)，GVL在多数指标匹配或优于NMP，DMI受高黏度拖累。结论：GVL综合表现最有前景替代NMP，DMI受限黏度。

2.6. Accelerated degradation study of the ISFIs（加速降解研究）

根霉脂肪酶加速降解显示GVL基植入体M_w下降更快(第7 d起P<0.05)，溶液pH降幅更大，与较快体外释放相符。SEM见NMP植入体均匀微结节表面，DMI为带坑洼异质表面，GVL为褶皱脊沟异质表面。结论：GVL基PLGA基质更快降解，归因于更均匀快速固化形成的初始微结构差异。

2.7. ISFIs for the release of testosterone（睾酮装载ISFI研究）

2.7.1. In vitro release studies（体外释放）

40% w/w PLGA含2.5% w/w睾酮三溶剂释放曲线无显著差异(P>0.05)，均呈三相(突释→平台→降解加速释放)。结论：疏水性药物下溶剂差异对体外释放影响减小。

2.7.2. In vivo pharmacokinetic studies（体内药代）

雌性SD大鼠皮下注射，三配方均呈三相血浆浓度-时间曲线。C_max(第1 d)：NMP 8.0±3.4 ng/mL，DMI 13.3±5.2 ng/mL，GVL 11.8±5.3 ng/mL。平台期(3–12 d)浓度DMI>GVL>NMP。AUC_0–21：NMP 58.9±12.0 ng·d/mL，DMI 97.1±12.0 ng·d/mL(P<0.05 vs NMP)，GVL 90.8±32.6 ng·d/mL(P>0.05 vs NMP)。第21 d NMP组出现二次升高效应(提示更多药物包埋待降解后释出)。结论：DMI与GVL基ISFI体内睾酮暴露量与NMP可比甚至略高，可替代NMP用于疏水性药物ISFIs。

讨论与结论总结

讨论指出GVL Hansen距离最小预示最佳PLGA溶解性，实测流变与注射性证实其与NMP相当，但因水混溶性好、扩散快致快速相反转形成塌陷非球形植入体——此形貌降低亲水模型药突释但因高比表面积加快后期释放并加速PLGA降解；DMI虽可形成球形植入体但因本征黏度高致40% w/w PLGA时需更大针头，实用性受限。体内睾酮模型证明二者可实现与NMP相当的缓释血浆水平。两阶段扩散模型量化了溶剂与药物在不同时期的D值，为ISFI溶剂筛选提供定量工具。局限性含模型假设球形植入体未考虑GVL实际不规则形貌，未来需发展移动边界模型并延长体内采样及组织学评估。

结论(Conclusion)部分翻译浓缩：

研究人员评价了DMI与GVL作为ISFI中NMP替代溶剂的性能。体外细胞毒性三者相当，DMI与GVL急性毒性低于NMP。GVL基ISFI流变与可注射性与NMP相似，DMI因高黏度需更大注射针径。NMP与DMI形成球形植入体，GVL形成塌陷不规则植入体。GVL溶出快致聚合物快速完全固化→亲水模型药突释降低，但因不规则形貌扩散路径短→整体释放更快。睾酮装载ISFI中DMI与GVL体外及体内释放均与NMP可比，NMP总体血浆暴露略低。综上，二甲异山梨醇(DMI)与γ-戊内酯(GVL)——尤以后者综合表现优——可作为原位形成植入剂中N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)可行的生物基替代溶剂。