SLC32A1下调通过介导PAI-1通路缓解肝星状细胞活化与肝纤维化

《Journal of Endocrinology》：Downregulation of SLC32A1 mediates the PAI-1 pathway in alleviating hepatic stellate cell activation and liver fibrosis

　　

肝纤维化（liver fibrosis，LF）是一种进行性慢性肝病，其特征为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度积聚，而这一过程主要由肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的异常活化驱动。已有研究报道，γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）受体可抑制HSC活化；而溶质载体家族32成员1（solute carrier family 32 member 1，SLC32A1）作为一种GABA转运蛋白，被推测参与LF调控，但其具体作用及潜在分子机制尚不明确。因此，本研究旨在探讨SLC32A1在HSC活化与LF进展中的作用，并阐明其下游调控机制。研究结果显示，LF患者中SLC32A1水平升高。体内实验表明，SLC32A1敲除可减轻小鼠CCl₄诱导的LF。体外研究显示，SLC32A1在TGF-β1刺激的LX-2细胞（HSCs）中特异性上调，而在THLE-2、THP-1或肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）中未见此现象。SLC32A1过表达加重LX-2细胞活化和纤维化，而其敲低可逆转TGF-β1诱导效应。机制研究表明，SLC32A1促进LX-2细胞中GABA和甘氨酸（glycine）胞吐。然而，无论外源性还是内源性GABA/甘氨酸均不影响SLC32A1敲低所介导的活化减弱，提示需进一步探索其他通路。在55个差异表达基因中，PAI-1显示出最大差异。关键的是，PAI-1过表达逆转了SLC32A1敲低所诱导的活化和纤维化下降。综上，这些发现表明，缓解HSC活化和LF的关键机制并非GABA通路，而是SLC32A1介导的PAI-1通路下调，提示SLC32A1可能成为LF新的潜在治疗靶点。

该研究发表于《Journal of Endocrinology》，围绕肝纤维化（LF）的关键致病环节——肝星状细胞（HSCs）异常活化——展开，系统阐明了溶质载体家族32成员1（SLC32A1）在肝纤维化发生发展中的作用，并进一步解析了其下游分子通路。肝纤维化是多种慢性肝损伤通向肝硬化的重要病理阶段，其本质是细胞外基质（ECM）持续沉积、肝脏正常结构被破坏。当前临床治疗主要依赖病因控制、抗氧化和抗纤维化干预，但不同病因所致肝纤维化对现有策略反应并不一致，且部分治疗存在肝外不良反应或肝毒性风险。因此，从分子层面寻找新的调控靶点，尤其是直接参与HSC活化的关键因子，具有重要理论意义和潜在转化价值。既往研究提示γ-氨基丁酸（GABA）受体激动可抑制HSC活化，而SLC32A1作为囊泡型GABA转运相关蛋白，其在肝纤维化中的作用尚未明确，因此研究人员围绕“SLC32A1是否参与HSC活化及其是否通过GABA相关机制发挥作用”这一问题进行了深入研究。

在研究设计上，研究人员首先纳入医院来源的49例受试者，包括10例健康对照和39例肝纤维化患者，并结合肝组织及血清学指标评估SLC32A1与纤维化程度的相关性。随后构建SLC32A1基因敲除小鼠，采用CCl₄诱导肝纤维化模型，结合肝组织病理学、透射电子显微镜（TEM）、Western blot（WB）、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和血清生化检测评价体内效应。体外部分以TGF-β1刺激LX-2细胞及原代HSCs建立活化模型，并在THLE-2、THP-1和LSECs中进行对照比较；通过质粒转染和siRNA敲低调控SLC32A1、PAI-1及GABA/甘氨酸合成相关基因表达，联合细胞活力、纤维化与炎症指标检测、RNA测序（RNA-seq）、双荧光素酶报告实验等解析下游机制。样本队列来源于临床患者和CCl₄诱导小鼠模型。

研究首先证实了SLC32A1与肝纤维化存在明确相关性。在临床样本中，肝纤维化患者肝组织中α-SMA、Collagen I和vimentin等经典纤维化标志物显著高于健康对照，同时SLC32A1表达也明显升高。进一步相关性分析显示，SLC32A1与α-SMA、Collagen I、vimentin以及ALT、AST、TBIL等肝损伤和肝功能指标均呈正相关。这一结果提示，SLC32A1不仅与纤维沉积程度相关，也与肝脏功能损伤状态密切相连，为其作为病理调控因子的判断提供了临床证据。

在“Knockout of SLC32A1 suppressed CCl₄-induced LF in mice”部分，研究人员通过CRISPR/Cas9构建SLC32A1敲除小鼠，并在CCl₄诱导模型中观察其体内效应。结果表明，SLC32A1缺失显著改善肝脏大体形态异常，降低肝体比，减轻炎症浸润和胶原沉积。TEM显示，敲除组肝组织中成纤维样细胞减少、肝小叶结构保存较好。分子水平上，vimentin、α-SMA、Collagen I和IL-6表达降低，血清ALT、AST、TBIL亦明显改善。这些结果共同说明，SLC32A1在体内促进肝纤维化进展，而其缺失具有保护作用。

在“The expression of SLC32A1 was upregulated in non-HEPs in LF mice models induced by CCl₄”部分，研究人员进一步追踪了SLC32A1的细胞来源。结果显示，在CCl₄诱导的肝纤维化小鼠中，SLC32A1主要在非实质细胞（non-HEPs）中升高，而在肝实质细胞（HEPs）中表达不明显。体外比较THLE-2、LX-2、THP-1和LSECs后发现，TGF-β1刺激仅在LX-2细胞中诱导SLC32A1显著上调，提示其具有纤维化条件依赖性和细胞类型特异性。这一发现将后续机制研究聚焦于HSCs，说明SLC32A1很可能通过直接调控星状细胞活化参与纤维化过程。

在“SLC32A1 facilitated LX-2 cell activation”部分，研究人员通过过表达和敲低实验直接验证了SLC32A1对HSC活化的影响。SLC32A1过表达促进Col1a2、Timp3、Mmp9和Il-6表达上升，并抑制Il-10表达，同时提高α-SMA和Collagen I蛋白水平；相反，敲低SLC32A1可逆转TGF-β1诱导的上述改变。由于这些指标分别涉及细胞外基质代谢、炎症调控和肌成纤维样表型形成，因此该部分结果明确支持SLC32A1具有促进LX-2活化、炎症反应和纤维化表型形成的功能。

在“SLC32A1 regulated LX-2 cell activation through a GABA/glycine transport-independent mechanism”部分，论文重点检验了最初提出的GABA相关假说。结果显示，SLC32A1确实影响LX-2细胞内外GABA和甘氨酸分布：过表达促进二者向细胞外转运，而敲低则相反。然而，无论采用GABA转运抑制剂SKF89976A、甘氨酸转运抑制剂RG-1678与ALX-1393，还是补充外源性GABA或甘氨酸，均未显著改变LX-2细胞活力及α-Sma、Collagen I、Timp1等活化指标。进一步敲低GABA合成相关酶GAD1、GAD2以及甘氨酸代谢相关酶SHMT1后，同样未影响SLC32A1敲低后的抑制效应。由此可见，尽管SLC32A1具备调控GABA/甘氨酸外排的能力，但这一路径并不是其驱动HSC活化的核心机制。

在“Downstream target screening for SLC32A1 to promote the activation of HSCs”部分，研究人员采用RNA-seq对Wt-CCl₄与KO-CCl₄小鼠肝组织进行转录组分析，以寻找SLC32A1下游效应分子。GO富集显示差异基因主要与代谢过程相关，结合纤维化和HSC相关基因集交叉筛选后共获得55个候选基因。其中，Serpine1，即编码纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）的基因，表现出最大差异倍数。随后在临床样本、小鼠组织和细胞模型中均证实，PAI-1与SLC32A1呈一致变化趋势：肝纤维化中PAI-1升高，SLC32A1敲除后PAI-1下降，SLC32A1过表达则提高PAI-1的mRNA、蛋白及分泌水平。双荧光素酶实验进一步显示，SLC32A1可增强PAI-1启动子活性，提示其对PAI-1具有转录水平调控作用。

在“Downregulation of SLC32A1 mediated the PAI-1 pathway to alleviate LX-2 cell fibrosis”部分，研究人员通过功能回复实验验证PAI-1是否为关键下游介质。首先发现，PAI-1单独敲低可抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞活力升高、纤维化标志物和炎症因子上调，而PAI-1过表达则增强这些效应。随后在SLC32A1敲低背景下补充过表达PAI-1，结果显示PAI-1可显著逆转SLC32A1敲低带来的保护作用，包括恢复细胞活力，重新升高Col1a2、Timp3、Mmp9、Il-6、α-SMA和Collagen I，并降低Il-10水平。相同趋势在原代HSCs中得到重复验证。这说明SLC32A1促进HSC活化、炎症和纤维化，关键依赖PAI-1这一效应分子，而并非依赖GABA通路。

讨论部分强调，肝纤维化治疗选择有限，HSC异常活化是其核心致病环节，因此寻找新的分子靶点具有重要意义。本研究首次报道SLC32A1参与肝纤维化调控，明确其在患者组织、动物模型和细胞模型中均表现为促纤维化分子。研究进一步指出，尽管SLC32A1是经典GABA转运相关蛋白，但在HSC中其致纤维化作用并不依赖GABA或甘氨酸转运/合成途径，而是通过上调PAI-1形成SLC32A1–PAI-1调控轴。该轴与既有纤维化网络相契合，因为PAI-1本身就是连接炎症信号与ECM积聚的重要介质。作者也指出，研究尚未系统解析SLC32A1上调的转录或表观遗传基础，也未对其他差异基因进行充分功能验证，因此机制网络仍待扩展。

研究结论部分可译为：本研究揭示，SLC32A1可通过调控PAI-1通路参与HSC活化及肝纤维化进程。此外，本研究表明，GABA并不是SLC32A1介导HSC活化的中介因素。该研究可为肝纤维化治疗提供新的思路和靶点，并为进一步研究肝脏疾病发病机制提供重要参考。总体而言，本文的核心贡献在于将SLC32A1从神经递质转运相关分子拓展为肝纤维化调控因子，提出了SLC32A1下调通过抑制PAI-1信号减轻HSC活化和肝纤维化的新机制，为肝纤维化的靶向干预提供了具有潜力的分子基础。