乙醇改性对大豆、豌豆及鹰嘴豆蛋白作为酪蛋白酸钠（Sodium Caseinate）替代物的结构、功能及风味特性的影响

《Journal of Food Composition and Analysis》：Effect of ethanol modification on the structural, functional, and flavor properties of soybean, pea, and chickpea proteins as sodium caseinate substitute

　　

本研究探讨了乙醇改性对三种典型豆类蛋白——即乙醇改性大豆分离蛋白（ethanol-modified soybean protein isolate, ASPI）、乙醇改性鹰嘴豆分离蛋白（ethanol-modified chickpea protein isolate, ACPI）和乙醇改性豌豆分离蛋白（ethanol-modified pea protein isolate, APPI）——的结构、功能及风味特性的影响，并评估了其作为酪蛋白酸钠（sodium caseinate, SC）替代物对椰浆体系结构、风味及感官特性的综合影响。研究发现，乙醇改性促进了蛋白形成更有序的结构，减少了蛋白聚集体的生成。因此，乙醇改性后蛋白的乳化性（emulsifying property）、凝胶强度（gel strength）及溶解度（solubility）均显著增强，其中ASPI提升最为明显。作为SC替代物，改性豆类蛋白提高了模拟椰浆的pH稳定性和热稳定性（thermal stability）。同时，ASPI组和ACPI组表现出高于APPI组的乳液稳定性（emulsion stability）。乙醇改性显著降低了改性蛋白及椰浆体系中关键异味挥发性物质（off-flavors）包括己醛（hexanal）、(E,E)-2,4-壬二烯醛（(E, E)-2,4-nonadienal）和1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）的含量，同时保留了关键呈香酯类物质的贡献。感官评价确认豆类蛋白改性显著提升了整体可接受度（overall acceptance），其中ASPI组接受度最高。这些发现为获取具有可比功能和风味特性的SC替代物提供了新策略。

《乙醇改性豆类蛋白作为酪蛋白酸钠替代物的结构与功能研究》论文解读

该研究由江南大学食品学院Zhuang Chai、Xiyue Tang、Caimeng Zhang、Yeming Chen及Xingfei Li开展，发表于《Journal of Food Composition and Analysis》。

一、研究背景与目的

全球消费者对健康饮食的关注推动了植物蛋白从传统膳食补充剂向主流蛋白源转变，食品工业大力投入开发动物蛋白的植物基替代品。大豆、豌豆和鹰嘴豆富含蛋白质及生物活性成分，广泛用于模拟肉制品、乳制品替代品及功能性食品。然而，相较于典型动物源蛋白如酪蛋白酸钠（Sodium Caseinate, SC），豆类蛋白因乳化活性弱及存在明显的"豆腥味"（beany off-flavor，主要由脂氧合酶途径催化的多不饱和脂肪酸氧化产生，关键挥发物包括己醛hexanal、1-辛烯-3-醇、(E,E)-2,4-壬二烯醛等醛酮醇类）而受限。传统热处理去异味易导致蛋白变性损害功能特性，有机溶剂萃取虽可去异味但通常牺牲功能性。椰浆（coconut milk）传统上依赖SC作为乳化稳定剂以防止相分离并增进口感，但其动物源属性不符合纯素诉求且致敏。因此，研究人员开展本研究，旨在通过85%及95%乙醇（ethanol）改性处理大豆、豌豆及鹰嘴豆蛋白，同步改善其结构有序度、溶解度和乳化功能并高效脱除脂溶性异味物质，评估其作为SC替代物在模拟椰浆（simulated coconut milk）体系中的应用表现。

二、主要关键技术方法

研究人员以低温脱脂豆粕、豌豆籽粒及鹰嘴豆籽粒为原料，经85%乙醇50℃浸提除杂质、95%乙醇二次处理、干燥后碱溶酸沉法（pH 10.0溶解—pH 4.5沉淀—中和至pH 7.0）提取获得乙醇改性豆类分离蛋白（ASPI、APPI、ACPI），未改性对照组为SPI、PPI、CPI；以商业SC为阳性对照。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析聚集体变化；高效液相色谱（HPLC）进行分子量分布（molecular weight distribution）分析；圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）测定二级结构（secondary structure）；测定氮溶解度指数（Nitrogen Solubility Index, NSI）、乳化活性指数（Emulsifying Activity Index, EAI）与乳化稳定性指数（Emulsifying Stability Index, ESI）、表面疏水性（surface hydrophobicity, H₀，ANS荧光探针法）、热诱导最小凝胶浓度（Minimum Gel Concentration, MGC）及质构特性；顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用（Headspace Solid-Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometer, HS-SPME-GC-MS）分析挥发性风味化合物及嗅感值（Odor Activity Value, OAV）；Zeta电位（ζ-potential）与粒度分析评估模拟椰浆在不同pH及热处理下的稳定性；激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM）观察乳液微观结构；16人培训后感官评定小组进行感官接受度评分（色泽/滋味/气味/质地，总分100）。

三、研究结果

3.1 乙醇改性对蛋白组成、分子量分布及二级结构的影响（Effect of ethanol modification on protein composition, molecular weight distribution, and secondary structure）

SDS-PAGE结果显示乙醇改性显著降低>250 kDa高分子量聚集体条带密度，表明乙醇破坏疏水相互作用与氢键使预形成聚集体解离并去除促聚集的醇溶性磷脂等杂质。HPLC分子量分布证实改性后高分子量可溶性聚集体（Peak 1）比例下降，低分子量亚基峰面积相对增加。CD光谱定量显示，与未改性相比，ASPI、APPI、ACPI的α-螺旋（α-helix）与无规卷曲（random coil）含量降低，β-折叠（β-sheet）与β-转角（β-turn）比例升高（如ASPI中β-sheet增加1.6%，random coil减少0.7%），表明乙醇驱动构象由无序向有序β-sheet转变，二级结构更趋近SC特征。

3.2 分子量分布（Molecular weight distribution）

对比三类豆类蛋白，改性后高分子聚集体峰面积均减小，证实乙醇处理普遍抑制豆类球蛋白（7S vicilin/β-conglycinin及11S legumin/glycinin）的聚合，其中大豆蛋白原本含较多大分子聚集体，改性后降幅明显；商业高温喷雾干燥大豆分离蛋白（High Oleic Soybean Protein Isolate, HOSPI）因热变性保留大量非二硫键聚集体。

3.3 二级结构（Secondary structure）

如表1数据，未改性SPI α-helix 17.7%、β-sheet 32.5%、random coil 30.2%；ASPI为α-helix 16.9%、β-sheet 34.1%、random coil 29.5%。乙醇降低体系介电常数增强肽链羰基与酰胺基静电吸引促链间氢键形成β-sheet。SC含α-helix仅9.7%、β-sheet达36.7%，改性豆类蛋白经构象调整更接近此模式。

3.4 乙醇改性对不同豆类蛋白功能特性的影响（Effect of ethanol modification on functional properties of different legume proteins）

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  3.4.1 疏水性（Hydrophobicity）：ANS荧光法测得ASPI、APPI、ACPI表面疏水性较未改性分别降低36.80%、19.90%、45.19%，有序β-sheet构象包埋了部分疏水残基，且乙醇洗脱了结合脂类。HOSPI因热变性暴露疏水区疏水性最高。
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  3.4.2 蛋白溶解度（Protein solubility）：pH 7.0下SPI、PPI、CPI经改性后NSI分别提升10.41%、15.04%、11.68%，ASPI达99.3%（高于SC的97.1%），归因于聚集体减少及表面疏水性降低。大豆自身含溶解性较好的7S α/α'亚基故总体溶解度高于豌豆/鹰嘴豆蛋白。
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  3.4.3 乳化特性（Emulsifying properties）：EAI方面SPI、PPI、CPI分别提升15.5%、11.4%、22.0%；ESI分别提升34.9%、48.8%、81.6%。溶解度提高及大聚集体减少促使更多蛋白分子快速吸附于油水界面，表面疏水性适度降低利于亲水-疏水平衡。ASPI与ACPI乳化稳定性优于APPI，三者ESI均优于SC。
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  3.4.4 质构特性（Textural property）：热诱导凝胶最小浓度（MGC）ASPI由11%降至10%，APPI由19%降至16%，但ACPI由15%升至17%（可能因鹰嘴豆伴生脂质洗脱影响网络形成）。22% (w/w)热诱导凝胶质构测定表明ASPI凝胶强度（Gel Strength, 11144.3 g）、硬度（Hardness, 11896.9 g）较SPI（5173.1 g、6420.7 g）翻倍，β-sheet增加促进致密网络。SPI因含高分子量11S/7S组分凝胶性能始终优于CPI>PPI。

3.5 改性豆类蛋白替代SC对模拟椰浆体系稳定性的影响（Impact of modified legume proteins as sodium caseinate substitute on the stability of simulated coconut milk system）

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  3.5.1 不同pH及加热温度下的粒径与Zeta电位（Particle size and zeta potential at varied pH and heating temperatures）：新鲜制备椰浆平均粒径各组无显著差异（0.05–0.2 μm），ASPI组Zeta电位-13.22 mV最接近SC（-14.32 mV）。调pH至等电点附近（pH 4.0–5.0）所有样品现絮凝粒径增大，但豆类蛋白组增幅小于SC组说明更优pH稳定性。95℃热处理下SPI、ASPI、ACPI及SC组粒径仍<0.3 μm保持稳定，PPI/APPI/CPI轻微升温诱导粒径增大（最大0.63 μm），短期（24 h）无肉眼分层。
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  3.5.2 微观结构（Microstructure）：CLSM（Nile Red染油脂/FITC染蛋白）显示八组椰浆油滴均匀分布、直径相近、无大规模聚集，与粒径结果吻合。

3.6 改性豆类蛋白替代SC对模拟椰浆体系挥发性风味的影响（Impact of modified legume proteins as sodium caseinate substitute on the volatile flavors of simulated coconut milk system）

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  3.6.1 不同改性豆类蛋白中挥发性风味物质（Volatile flavor substances of different modified legume proteins）：未改性豆类蛋白富含己醛、1-己醇、2-庚酮、壬醛、苯甲醛等豆腥相关挥发物。乙醇改性后醛/酮/醇总含量分别下降约77–90%、44–91%、81–90%，关键己醛降低>93%（ASPI降95.4%）。OAV>1的关键呈味物（nonanal、hexanal、(E,E)-2,4-nonadienal、1-octen-3-ol、1-hexanol等）绝对浓度大幅削减但相对贡献率因背景简化未明显下降。ASPI与ACPI挥发谱最接近SC。
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  3.6.2 改性豆类蛋白基椰浆的挥发性风味（Volatile flavor of modified legume protein-based coconut milk）：椰浆中酯类（ethyl octanoate、ethyl decanoate等典型椰香物质）主要来自椰汁且被良好保留；豆类蛋白引入的豆腥醛酮醇在改性组（ASPI/APPI/ACPI）中显著低于未改性组，己醛在ASPI组降至12.75 μg/kg、ACPI组3.87 μg/kg。OAV分析显示酯与醛仍为关键香气贡献者，改性不影响特征椰子酯含量。

3.7 豆类蛋白替代SC对模拟椰浆感官接受度的影响（Impact of legume proteins as sodium caseinate substitute on the sensory acceptance of simulated coconut milk）

未改性豆类蛋白椰浆呈微黄（鹰嘴豆组最显著）色泽评分低，乙醇改性使样品外观更白。整体感官得分排序为SC > ASPI > ACPI > APPI > HOSPI > SPI > PPI > CPI。ASPI组在气味与滋味维度最优，ACPI色泽分最高，APPI质地好但色泽气味分低。ASPI基椰浆整体接受度最接近SC。

四、讨论与结论总结（Conclusion）

研究人员得出结论：乙醇改性使豆类蛋白形成更有序结构、减少大分子聚集体，从而显著提升乳化性、凝胶强度及溶解度（ASPI尤为突出）。作为SC替代物，改性蛋白通过增大Zeta电位绝对值与减小液滴粒径提高模拟椰浆pH与热稳定性，ASPI与ACPI乳液稳定性优于APPI。乙醇改性大幅削减豆类蛋白及椰浆中关键豆腥挥发物（hexanal、(E,E)-2,4-nonadienal、1-octen-3-ol等），ASPI中异味物水平相当或低于SC。感官评价显示ASPI基椰浆整体可接受度最高，接近SC对照组。研究表明适当乙醇改性豆类蛋白是开发具优良功能与风味特性的SC植物基替代物的有效新策略。