椴树（Tilia spp.）蜂蜜在LPS诱导的RAW264.7细胞与小鼠急性肺损伤模型中的抗炎作用

《Journal of Functional Foods》：Anti-inflammatory role of linden (Tilia spp.) honey in LPS-induced RAW264.7 cells and mouse model of acute lung injury

　　

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种以肺部炎症反应为特征的严重呼吸系统疾病。本研究采用体外与体内模型，考察椴树（Tilia spp.）蜂蜜（linden honey，LH）的抗炎活性。LH预处理通过下调LPS刺激RAW264.7细胞中IκBα和p65的磷酸化，以及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）蛋白表达，抑制Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，提示其可减轻炎症反应。在LPS注射小鼠中，LH处理组可显著降低LPS诱导的血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。此外，与仅给予LPS组相比，LH改善了肺损伤相关指标，包括肺湿/干重比、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的总细胞数、蛋白浓度以及促炎细胞因子TNF-α水平。LH还抑制了肺组织中的TLR4/NF-κB信号通路。综上，LH可能缓解LPS介导的炎症反应，支持其作为炎症性肺部疾病天然治疗策略的应用潜力。

《Journal of Functional Foods》发表的这项研究围绕椴树（Tilia spp.）蜂蜜（linden honey，LH）的抗炎潜力展开，聚焦其对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导炎症反应及急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的干预作用。研究背景在于，ALI是由过度急性炎症级联反应驱动的严重肺部炎症性疾病，其核心病理过程包括肺泡-毛细血管屏障破坏、肺水肿、炎症细胞浸润和气体交换障碍。LPS作为革兰阴性菌细胞壁主要成分，可通过激活Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）及其下游核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号轴，诱导促炎细胞因子和一氧化氮等炎症介质大量生成，因此LPS诱导模型被广泛用于ALI发病机制和干预策略研究。尽管蜂蜜已被报道具有抗炎、抗菌、促创面修复等活性，且椴树蜂蜜富含多酚、黄酮、酚酸等生物活性成分，但其对LPS诱导肺部炎症的作用及分子机制仍缺乏系统证据。基于此，研究人员分别在RAW264.7巨噬细胞和LPS诱导ALI小鼠模型中评估LH的抗炎效应，并重点考察其是否通过调控TLR4/NF-κB信号通路发挥保护作用。

方法上，研究人员首先测定LH的总多酚含量以及DPPH、ABTS自由基清除能力；随后在RAW264.7巨噬细胞中通过MTT法评估细胞活力，以Griess法检测一氧化氮（nitric oxide，NO）生成，并采用Western blot检测TLR4、p-IκBα、p65、p-p65、iNOS与COX-2蛋白表达。体内部分采用雄性ICR小鼠，随机分为对照组、LPS组和LPS+LH组，LH按0.5 g/kg/day灌胃7 d后进行LPS腹腔注射诱导ALI，4 h后采集血清、BALF和肺组织；通过肺湿/干重比、BALF总细胞数及蛋白含量、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、肺组织苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色及Western blot综合评价炎症与肺损伤程度。动物样本来源为庆尚国立大学动物实验体系中的5周龄雄性ICR小鼠。

研究结果部分显示如下。

3.1. In vitro antioxidant capacity and total polyphenol content of LH
研究人员首先评估LH的体外抗氧化能力和总多酚含量。结果表明，LH总多酚含量为1.28 ± 0.03 mg GAE/g honey；在DPPH与ABTS自由基清除实验中均表现出浓度依赖性抗氧化活性，其IC₅₀分别为78.23 ± 3.51 mg/mL和70.84 ± 0.27 mg/mL。该结果说明LH具有较明显的体外自由基清除能力，而这种抗氧化特征被认为构成其后续抗炎活性的生化基础。

3.2. Inhibitory effect of LH on NO production in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages
为明确LH在细胞水平的安全性与抗炎效应，研究人员先检测其细胞毒性，再检测NO生成。MTT结果显示，在50–1000 μg/mL范围内，LH对RAW264.7细胞无明显细胞毒性，细胞活力维持在96.54%–113.94%。在LPS刺激下，NO生成显著升高，而LH预处理可在50–500 μg/mL范围内显著抑制LPS诱导的NO释放，其中200 μg/mL抑制效应最强；1000 μg/mL则未见抑制作用。基于此，后续机制实验选用50、100和200 μg/mL浓度。该部分结果表明，LH可在无明显细胞毒性的条件下抑制巨噬细胞炎症反应的重要介质NO生成。

3.3. Effect of LH on inflammation-related proteins expression in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages
为阐明LH抑制炎症反应的分子机制，研究人员分析了TLR4/NF-κB通路相关蛋白及其下游炎症酶表达。结果显示，LPS显著上调TLR4表达，并促进IκBα和p65磷酸化，提示NF-κB信号通路被激活。LH预处理抑制TLR4、p-IκBα和p-p65/p65的升高，其中200 μg/mL抑制最明显。与此同时，LPS诱导iNOS和COX-2蛋白上调；LH显著降低iNOS表达，与NO下降结果一致，而对COX-2的抑制在50 μg/mL时达到统计学显著。该部分说明，LH在巨噬细胞中的抗炎作用与TLR4/NF-κB信号轴抑制密切相关，并伴随下游炎症效应分子表达下降。

3.4. Effect of LH on LPS-induced lung histopathological changes and pulmonary edema in ALI mice
在体内模型中，研究人员进一步评估LH对LPS诱导肺组织损伤的保护作用。与对照组相比，LPS显著升高肺湿/干重比，提示肺水肿形成；LH处理后该指标明显下降。LPS还使BALF总细胞数从3.68 × 10⁴/mL升至29.12 × 10⁴/mL，BALF总蛋白含量也明显增加，反映炎症细胞募集增强及肺泡-毛细血管屏障通透性升高；LH均显著逆转这些变化。H&E染色显示，LPS引起肺泡隔增厚、炎症细胞浸润、组织水肿/出血等典型病理损伤，而LH处理后这些病理改变明显减轻，肺损伤评分同步下降。该部分结果证明LH可减轻LPS诱导的肺水肿、炎症浸润与结构损伤。

3.5. Inhibitory effect of LH on pro-inflammatory cytokine releases in serum and BALF of LPS-injected ALI mice
为评价LH对全身及局部炎症因子的调控作用，研究人员测定血清和BALF中的TNF-α、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）。结果显示，LPS注射后血清TNF-α、IL-1β和IL-6均显著升高；LH预处理显著降低血清TNF-α，但对血清IL-1β和IL-6未达到统计学显著性。BALF中，LPS同样显著升高三种促炎细胞因子，而LH显著抑制TNF-α和IL-1β释放，分别降至53.75 pg/mL和12.52 pg/mL，相较LPS组95.42 pg/mL和21.72 pg/mL明显下降；BALF中IL-6则未见显著变化。该结果表明，LH对ALI早期炎症细胞因子风暴具有调节作用，且以TNF-α和IL-1β抑制更为突出。

3.6. Effect of LH on inflammation-related proteins expression in LPS-injected ALI mice
为验证体内抗炎机制，研究人员对肺组织炎症相关蛋白进行Western blot分析。结果表明，LPS显著上调TLR4表达，并增强IκBα和p65磷酸化；LH预处理则明显抑制上述变化，尤其显著降低p-p65/p65比值，提示NF-κB激活被抑制。同时，LH还显著下调下游炎症酶iNOS与COX-2的蛋白水平。该部分结果与细胞实验趋势一致，说明LH在体内同样通过干预TLR4/NF-κB信号通路而减轻肺组织炎症反应。

讨论部分围绕LH的抗氧化与抗炎双重属性展开。研究指出，蜂蜜的功能活性与其植物来源、地理环境和加工条件密切相关，而LH此前已被报道具有抗氧化、抗菌、抗病毒及免疫调节作用。本研究进一步将其功能延伸至LPS诱导炎症和ALI情境。研究结果提示，LH的总多酚及自由基清除活性可能为其抑制炎症反应提供基础支持。NO在生理状态下参与宿主防御与稳态维持，但过量NO可放大氧化应激和组织损伤；因此LH对NO与iNOS的抑制具有明确生物学意义。与此同时，TLR4/NF-κB是LPS炎症信号转导的关键轴，LH在体内外均可抑制TLR4、p-IκBα和p-p65/p65，并下调iNOS、COX-2，提示其抗炎作用具有较清晰的分子靶向性。对于ALI病理特征，LH降低肺湿/干重比、BALF细胞数和蛋白水平，并改善病理形态学损伤，说明其能够减轻炎症细胞浸润、血管渗漏和肺水肿。细胞因子分析则显示，LH对TNF-α抑制尤为稳定，而对IL-6和部分IL-1β指标影响较有限，提示其并非对所有炎症介质实施广谱抑制，而更可能表现为对特定炎症通路的选择性调节。研究还提到，LH可能富含咖啡酸、阿魏酸、丁香酸和对香豆酸等酚类成分，这些物质在既往研究中与缓解肺部炎症相关，但本研究未直接进行化学成分谱分析，因此仅能说明LH整体与TLR4/NF-κB调控相关，尚不能界定具体活性成分及其直接因果机制。总体而言，讨论部分强调，LH在体外巨噬细胞模型和体内ALI模型中均表现出一致的抗炎保护效应，支持其作为功能性食品成分或炎症性肺病膳食干预候选物的研究价值。

研究结论部分可译为：本研究考察了LH在LPS处理巨噬细胞和ALI小鼠模型中的抗炎作用及潜在机制。结果表明，LH预处理可显著降低NO生成，并抑制巨噬细胞中的TLR4/NF-κB信号通路。此外，LH减轻了小鼠肺组织的组织病理学损伤，并降低了BALF和血清中的促炎细胞因子水平，尤其是TNF-α。LH缓解肺功能障碍的机制涉及对TLR4/NF-κB信号轴的抑制。本研究的局限性在于，尚未鉴定介导LH保护作用的特异性生物活性成分，因此对其精确抗炎机制的认识仍不完整。尽管如此，本研究仍为LH的抗炎效能提供了重要依据，并支持其进一步开发为功能性食品成分或炎症性肺部疾病的膳食干预策略。