负载蜂胶(Coffea spp.)的固体脂质纳米粒(Solid Lipid Nanoparticles, SLNs)靶向与胃肠道疾病相关的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

《Journal of Functional Foods》：Propolis-loaded solid lipid nanoparticles targeting H. pylori associated with gastro-intestinal diseases

　　

摘要：蜂胶(Propolis)是一种富含多酚(polyphenolic)和黄酮类化合物(flavonoid compounds)的天然物质，因其强效抗菌及抗炎特性而为人所知，尤其对参与严重胃部疾病发病机制的病原体——幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)具有良好效果。然而，其治疗应用受限于水溶性差、理化稳定性低及生物利用度低等缺点。为克服上述局限，本研究制备了负载蜂胶乙醇提取物(Propolis Ethanolic Extract, PEE)的固体脂质纳米粒(Solid Lipid Nanoparticles, SLNs)，旨在提高PEE的稳定性并增强其生物学活性。研究人员通过浸渍法(maceration)获取PEE并以高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)及分光光度法对其进行表征，随后制备了11种SLNs制剂(PEE-SLN1–11)。其中PEE-SLN10为最优处方，具良好理化特征：平均粒径161.71 nm、多分散指数(Polydispersity Index, PDI) 0.14、ζ-电位 -23.13 mV、包封率(Entrapment Efficiency %, EE%) 86%。透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)与差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry, DSC)证实了纳米尺度的球形形貌及热稳定性。体外(in vitro)研究显示PEE-SLN10在模拟胃肠液中呈白杨素(chrysin)的缓释特征。PEE-SLN10在热应激、模拟胃肠环境及长期储存下均表现良好稳定性，且在平行人工膜渗透性检测(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay, PAMPA)与EpiIntestinalTM体外实验模型中显示渗透性及肠道摄取显著增强。抗菌实验表明其对H. pylori的抑制活性提高；大蜡螟(Galleria mellonella)体内(in vivo)模型证实该制剂具生物相容性与安全性。

论文解读：负载蜂胶提取物的固体脂质纳米粒靶向幽门螺杆菌防治胃肠道疾病的研究

本研究发表于Journal of Functional Foods，针对蜂胶(Propolis)因水溶性差、化学不稳定、口服生物利用度低及在胃肠道内快速代谢而难以临床转化的问题，研究人员提出采用固体脂质纳米粒(Solid Lipid Nanoparticles, SLNs——以固态脂质为核、表面由表面活性剂稳定的纳米级胶体载体系统)包封蜂胶乙醇提取物(Propolis Ethanolic Extract, PEE)，以保护其多酚类活性成分并改善胃肠道递送效率，实现针对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)相关胃部疾病的靶向抗菌及抗炎作用。研究人员经处方筛选获得最优SLN制剂PEE-SLN10，系统表征其理化性质、稳定性、体外释放、肠渗透性、抗H. pylori活性、巨噬细胞免疫调节效应及大蜡螟(Galleria mellonella)体内安全性，证实SLN包封可显著提高PEE的稳定性、肠道通透性及抗H. pylori效力，并具良好生物相容性，为天然产物口服纳米递送系统的开发提供依据。

主要关键技术方法

研究人员采集意大利基耶蒂地区原蜂胶，以96%乙醇浸渍(maceration)法制备PEE并经HPLC及Folin-Ciocalteu/AlCl₃法测定总酚(Total Phenolic Content, TPC)与总黄酮(Total Flavonoid Content, TFC)含量。以三硬脂酸甘油酯(Tristearin, TS)为脂质核心、大豆卵磷脂(Soy Lecithin, SL)为助乳化剂、Brij 78为表面活性剂，采用改良乳化-蒸发-固化法(emulsification-evaporation-solidification method)制备系列PEE-SLNs，通过动态光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)测粒径/PDI、电泳光散射测ζ-电位、HPLC测包封率(EE%)筛选最优处方。以TEM观察形态，DSC分析热行为。考察制剂在模拟胃液(Simulated Gastric Fluid, SGF)、模拟肠液(Simulated Intestinal Fluid, SIF)及热处理下的稳定性；以透析袋法在SGF(2 h)转SIF(至24 h)条件下进行体外释放研究，以chrysin为标志物，同时监测TPC/TFC释放。用平行人工膜渗透性检测(PAMPA-GI)及EpiIntestinal^TM三维肠组织模型评价渗透性。采用微量肉汤稀释法测对H. pylori ATCC 700684(克拉霉素耐药株)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)ATCC 25586及艰难梭菌(Clostridioides difficile)ATCC 700057的最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)。以PMA诱导人单核细胞系分化为巨噬细胞，LPS建立炎症模型，MTT法测细胞代谢活性，MitoSOX^TM探针流式细胞术检测线粒体超氧阴离子生成。经大蜡螟(Galleria mellonella)幼虫注射评估体内急性毒性。

3.1. PEE characterization

研究人员通过HPLC鉴定PEE中含咖啡酸(caffeic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、槲皮素(quercetin)、咖啡酸苯乙酯(Caffeic Acid Phenethyl Ester, CAPE)、白杨素(chrysin)及山奈素(galangin)，其中chrysin占比约6%；TPC为583.64 ± 73.39 mg GAE/g，TFC为153 ± 20.2 mg Q/g，提取率74%，确认PEE富含多酚与黄酮类活性成分。

3.2. PEE-SLNs preparation and characterization

研究人员制备11组不同脂质-提取物比、脂质-表面活性剂比及总脂质量的处方，筛选出PEE-SLN10（TS 80 mg、SL 16 mg、Brij 78 220 mg、PEE 120 mg）为最优：粒径161.71 nm、PDI 0.14、ζ-电位 -23.13 mV、EE%达86.08%；TEM显示为近球形、尺寸分布均匀；包封后TPC降至117.43 mg GAE/g、TFC降至24.9 mg Q/g但仍保留活性成分。增加脂质/表面活性剂超出PEE-SLN10比例反而降低EE%，提示适度脂质基质利于PEE增溶与嵌入。

3.3. Differential scanning calorimetry (DSC)

DSC结果显示纯三硬脂酸甘油酯熔融峰55.66 °C(ΔH=161.46 J/g)，原蜂胶宽峰约47.85 °C(ΔH=67.58 J/g)；PEE-SLN10熔融峰移至49.46 °C且ΔH大幅降至17.95 J/g，未负载SLN10的峰亦偏移，表明PEE成功包入脂质基质并使晶格有序度下降(结晶度降低)，有利于控释。

3.4. PEE-SLN10 stability studies

长期储存(室温避光)112天内粒径与PDI基本不变，EE%渗漏<10%，第112天ζ-电位绝对值略降但未破坏胶体完整性；在SIF中粒径略增至~200 nm后微降，在SGF中2 h内增至~300 nm(6 h无法检测)——研究人员指出SGF中纳米粒解体属预期优势，可促进胃内快速释药作用于H. pylori；40–90 °C热处理下粒径/PDI/ζ-电位无明显变化，具加工与储存兼容性。

3.5. In vitro release studies

以chrysin为标志物，游离PEE即刻释放，PEE-SLN10呈双相释放：SGF中前2 h释放约20%(表层吸附成分+SGF致脂质基质扰动)，转入SIF后持续缓释——黄酮类24 h累积释放约50%、总酚约40%，具胃内快速初释+肠道延效的双重靶向潜力。

3.6. Permeability studies

3.6.1. PAMPA studies：游离PEE的表观渗透系数(P_e)为0.12×10^-6cm/s，PEE-SLN10升至0.30×10^-6cm/s，虽低于高渗阈值(1×10^-6cm/s)但显著改善被动扩散，归因于脂质载体增溶及膜相互作用。

3.6.2. Permeability studies using EpiIntestinal^TM：PEE-SLN10中chrysin的表观渗透系数(P_app)为3.22×10^-7cm/s，较游离PEE有所提升但仍偏低，可能与纳米粒上皮面聚集或外排转运有关；研究人员建议后续引入黏附涂层(如壳聚糖、透明质酸)延长黏膜滞留以进一步提升吸收。

3.7. Biological studies

3.7.1. MIC and MBC determination of PEE and PEE-SLN10 vs F. nucleatum, C. difficile, and H. pylori：游离PEE及PEE-SLN10对F. nucleatum与C. difficile MIC均>128 μg/mL(无抑制)，但对H. pylori，游离PEE的MIC/MBC为32/64 μg/mL，PEE-SLN10降至MIC 0.06 μg/mL、MBC 0.25 μg/mL(未负载SLN10为MIC 0.5 μg/mL)，表明SLN包封显著增强抗H. pylori活性，可能与脂质基质保护多酚、促进chrysin抑制H. pylori脲酶及膜作用有关。

3.7.2. Cell metabolic activity：基础状态下PEE与PEE-SLN10在2 μg/mL、24 h对巨噬细胞代谢活性无显著影响，具良好生物相容性；高浓度呈剂量依赖性代谢下降。LPS诱导炎症后细胞代谢亢进，PEE、PEE-SLN10及未负载SLN10均能拮抗LPS引起的代谢升高，提示潜在抗炎/免疫调节作用。

3.7.3. Generation of superoxide anions under pro-inflammatory conditions in the presence of the PEE and PEE-SLN10：LPS刺激使线粒体超氧阴离子显著升高；游离PEE处理未见明显抑制甚至高浓度微升，而PEE-SLN10剂量依赖降低超氧阴离子水平(32–64 μg/mL时显著)，说明纳米包封改善蜂胶活性成分调控氧化还原失衡的能力。

3.7.4. In vivo toxicity studies using the G. mellonella model：注射PEE-SLN10(0.024 mg/kg)、游离PEE(12.8 mg/kg)、相应空白辅料及未负载SLN10后，大蜡螟幼虫4天内无死亡，证实制剂在测试剂量下无急性体内毒性。

讨论与结论翻译

研究人员得出结论：SLNs是克服PEE水溶性差及不稳定等限制的有效策略。优化得到的PEE-SLN10能高效包封关键多酚成分，实现渐进释放、渗透性增强及在体液与热应激下的理化稳定性提升。PEE包封入SLN可保护提取物免于降解，从而增强抗微生物活性及氧化应激调节能力，提示纳米载体系统在稳定性、渗透性及蜂胶活性物递送方面的优势。PEE-SLN10有望作为靶向胃部的H. pylori治疗递送系统，并可进一步优化用于肠道应用。未来研究将扩展胃肠病原菌谱并阐明尤其是抗H. pylori的作用机制。总体而言，结果支持SLNs作为多酚化合物递送的生物相容性平台，为进一步的体内药代动力学及机制研究提供依据。