利用显微计算机断层扫描对斑马鱼体内微塑料进行三维追踪

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Three-dimensional Tracking of Microplastics in Zebrafish Using micro-Computed Tomography

　　

了解微塑料（microplastics, MPs）摄入后的归宿对于评估其生物学效应至关重要，然而追踪生物体内这些颗粒仍是一项重大分析挑战。常规检测方法因需破坏性样品制备常丢失空间分布信息。本研究提出一种新颖、非破坏性的显微计算机断层扫描（micro-computed tomography, microCT）方法，用于在斑马鱼（Danio rerio）体内对MPs进行真实的三维（three-dimensional, 3D）追踪。研究人员采用基于摄食的暴露设计，可视化了老化聚乙烯（polyethylene, PE）MPs摄入、分布于胃肠道及排出的过程。应用连续暴露与短期暴露两种互补方案，分别模拟环境相关条件及评估MPs经肠道的运动。结果证实MPs被摄入，揭示其渐进性向後肠（posterior intestine）移动，可可视化排出动力学并估算各肠段颗粒滞留量。连续暴露反映持续污染环境下的累积摄入模式，短期暴露则更清晰解析MPs转运动态。本方法为完整水生生物体内MPs追踪提供了真实、可重复且非破坏性的框架，可直接可视化摄入后过程，支持未来关于MPs摄入后行为的研究，揭示MPs蓄积部位，从而更好理解生态毒理学背景下的潜在生物学效应。

利用显微计算机断层扫描（microCT）对斑马鱼体内微塑料进行三维追踪的研究解读

《Journal of Hazardous Materials Advances》刊载的此项研究由Viktória Parobková、Gabriela Kal?íková、Luká? Male?ek等团队合作完成。微塑料（microplastics, MPs，粒径<1 mm的合成聚合物颗粒）广泛存在于水生态系统中，可被水生生物摄入并引发肠道梗阻、炎症等不良反应，但MPs摄入后在消化道内的空间分布、滞留时间及转运动力学（即摄入后归宿，post-ingestion fate）尚不明晰。传统检测手段如傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy, FTIR）、拉曼光谱及热裂解气相色谱—质谱联用（pyrolysis–gas chromatography–mass spectrometry, pyrolysis-GC-MS）虽能鉴定化学成分，但需酶解或化学消化组织，彻底破坏MPs在组织中的原位空间信息，且存在 airborne污染风险；荧光标记法受限于透明生物种且无法提供真实颗粒的X射线衰减差异，偏振光显微镜需制作组织切片同样具破坏性。X射线显微计算机断层扫描（micro-computed tomography, microCT）可在不破坏完整生物样本的前提下实现高分辨率三维成像，此前课题组已证明经口灌胃（oral gavage）导入聚乙烯（polyethylene, PE）微球可用microCT检出，但灌胃绕过自然摄食行为，缺乏环境相关性。因此，研究人员开展本研究，旨在建立基于自然摄食暴露的microCT方法，验证斑马鱼对带生物膜老化MPs的自愿摄入，明确适宜暴露浓度与采样时间点，通过连续与短期暴露实验三维追踪MPs在活体固定后完整消化道中的分布与排出，最终确立非破坏性MPs体内追踪的技术框架。

主要关键技术方法

研究人员选用粒径30–110 μm的纯PE微球（Cospheric LLC），经斯洛文尼亚Glin??ica溪流水体振荡培养4周形成表面生物膜（biofilm）以增强环境相关性及摄入率，镜检确认生物膜形成。选用约20月龄野生型成年斑马鱼（Danio rerio），预适应72 h并禁食，设置两暴露组：(1) 连续暴露组（Exp1）——暴露于0.1、1、10 mg/L MPs悬浮液6–12 h；(2) 短期暴露组（Exp2）——1 mg/L MPs中摄食10 min后转至清洁水，于1、3、6、9、12 h后取样。各时间点取斑马鱼经MS-222过量麻醉处死，4%多聚甲醛固定；样本经梯度乙醇脱水、1%碘（Iodine, I?）—甲醇溶液染色增强软组织对比度，置1%琼脂糖中稳定，使用nano3dx microCT系统（Rigaku，1200 W旋转阳极X射线源，2.5×物镜）扫描，体素大小3 μm，滤波反投影重建。重建数据导入VG Studio Max 2025.2，采用基于神经网络分类模块分割MPs及肠道，人工划分前肠（anterior intestine，首弯前）、中肠（middle intestine，首尾弯间）、后肠（posterior intestine，末弯后），通过Porosity/Inclusion模块定量粒径，GraphPad Prism 5一键指数衰减模型拟合消除半衰期（half-life, t_1/2）。

研究结果

3.1. 微塑料暴露浓度选择（Selection of microplastic exposure concentration）

研究人员在Exp1中取暴露9 h、三种浓度（0.1、1、10 mg/L）斑马鱼肠道microCT数据做分割与3D可视化。结果：10 mg/L组总MPs分割体积0.54 mm3，沿肠分布较均匀（前肠37%、中肠43%、后肠20%），出现>120 μm表观粒径簇团（clustering，颗粒紧密聚集致分割视为单大对象）；1 mg/L组总体积0.09 mm3，分布略向后移（前肠50%、中肠16%、后肠34%），粒径主峰30–60 μm，簇团减少；0.1 mg/L组总体积0.004 mm3，少量MPs集中于中、后肠（各约47%、50%），粒径30–90 μm为主，几无簇团。表明1 mg/L兼顾足量检出与低簇团干扰，0.1 mg/L（≈978 MPs/L）具环境相关性仍可检出且利于单颗粒分割。

3.2. 确定最佳样品采集时间（Determining the optimal time for sample collection）

Exp1（连续暴露，1 mg/L）6、9、12 h采样：6 h各肠段均有MPs（前26%、中39%、后35%）；9 h前肠比例升至50%、中肠降至16%、后肠34%；12 h MPs高度集中于后肠（94%），前、中肠极少（各2%、4%），反映持续摄入掩盖清晰转运阶段。Exp2（短期暴露，1 mg/L）1–12 h采样：1 h MPs绝大部分（96%）位于前肠；3 h主移至中肠（82%）并开始入后肠（17%）；6 h仅存中、后肠（9%、91%）；9 h全聚后肠（100%）；12 h后仍见后肠残留（85%），少量回现中、前肠（可能系肠道异步转运或黏液滞留释放）。依据Exp2数据拟合消除曲线得MPs胃肠道消除半衰期为4.2 h，并绘制各肠段MPs占比随时间变化图展示转运轨迹。

讨论与结论总结

讨论指出老化形成biofilm的PE微球可被斑马鱼自愿摄入，证实环境相关性；高浓度致簇团影响分割精度及粒径/数量定量，低环境相关浓度适合精确单颗粒分析；连续暴露因持续摄入模糊转运时相，短期暴露清晰呈现MPs由前→中→后肠推进及逐步排出动态，后肠12 h仍有残留提示MPs比普通食物转运慢或存在肠褶/黏液暂留。microCT下限检出粒径~30 μm，限於此无法追踪可跨膜纳米级颗粒；本法使用PE球为概念验证，未来需拓展至多种聚合物类型、不规则形状及更小尺寸；microCT本身不提供化学指纹，但可与后续组织消解—光谱法联用。局限性含每时间点n=2为方法学可行性验证非统计学效力生物学结论，需增 replicates。

结论部分译文：本研究证明microCT是适用于斑马鱼胃肠道内MPs追踪的非破坏性工具。基于摄食暴露设计确立了MPs摄入、分布及排出可视化的方法。结果证实带biofilm老化MPs被自愿摄入，且MPs一致性向后肠移动。比较连续与短期暴露显示短期设计更精准解析MPs转运动态，连续暴露则反映持续污染环境下的累积摄入。本工作为真实暴露情景下水生生物MPs行为研究提供方法学基础，可探明摄入后动力学及颗粒肠道内行为，所建框架可适配不同聚合物类型、形状及暴露条件，支持改进MPs生态毒理学及健康风险评价。未来将拓展至具环境代表性的多聚合物类型与形状MPs，并增加生物学重复数以稳健评估MPs对水生生物影响。