与高原中老年人肌少症(sarcopenia)及肌肉力量相关的循环免疫代谢标志物：一项整合多组学(multi-omics)研究

《The Journal of nutrition, health and aging》：Circulating immunometabolic markers associated with sarcopenia and muscle strength at high altitude: An integrated multi-omics study

　　

摘要：目的　采用整合多组学(multi-omics)方法，阐明与居住在海拔2000 m高原地区中老年人肌少症(sarcopenia)及肌肉力量相关的循环免疫代谢(immunometabolic)谱特征。设计　病例对照研究，纳入120例中老年受试者，含肌少症组60例及匹配对照组60例（阳性对照为35例骨质疏松症(osteoporosis)患者，阴性对照为25例健康人）。地点　中国云南昆明高海拔地区（2000 m）。检测　对血液标本行整合转录组(transcriptomic)、蛋白组(proteomic)及代谢组(metabolomic)分析，筛选差异表达基因、蛋白及代谢物，行通路富集及蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)分析；候选标志物进一步通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、与握力(handgrip strength, HGS)的相关性分析，以及体外(in vitro)和体内(in vivo)实验验证。结果　肌少症患者体重、体质指数(body mass index, BMI)及腰围显著低于两对照组，四肢骨骼肌肌量指数(appendicular skeletal muscle mass index, ASMI)低于阳性对照组及阴性对照组女性受试者，女性握力显著降低（P＜0.05）。多组学分析显示差异通路主要涉及炎症、免疫应答及代谢。整合分析确定CD14、Fcγ受体II-a（Fc-gamma receptor II-a, FCGR2A）及富亮氨酸α-2-糖蛋白1（leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1, LRG1）为与肌少症相关的关键分子（P＜0.05）；代谢组主要与鞘脂(sphingolipid)、甘油磷脂(glycerophospholipid)及氨基酸代谢相关。肌少症患者血清LRG1和CD14浓度显著升高，性别交互作用无统计学意义（P＞0.05）；男性受试者中LRG1和CD14与握力呈正相关（P＜0.05）。实验模型进一步支持肌少症相关状态下CD14、FCGR2A和LRG1上调。结论　高原中老年人肌少症伴特征性循环免疫代谢谱改变，CD14、FCGR2A和LRG1可作为候选循环标志物，CD14和LRG1与肌肉力量的关联提示其潜在临床意义，需在更大队列中进一步验证。

论文解读：《与高原中老年人肌少症及肌肉力量相关的循环免疫代谢标志物：一项整合多组学研究》

该研究发表于《The Journal of Nutrition, Health & Aging》。肌少症(sarcopenia)是老年人常见的进行性骨骼肌量减少、肌力下降及躯体功能减退综合征，全球患病人数持续攀升，目前缺乏有效的药理学干预手段，且确切发病机制尚未完全阐明。除神经源性、内分泌及营养因素外，慢性炎症、免疫失调及蛋白质稳态丧失被认为参与其发病。此外，长期居住高海拔(＞1500 m)地区因低氧性氧化应激可加速衰老及肌少症发生，但该特定人群肌少症的分子特征尚不清楚。为此，研究人员在云南昆明海拔2000 m地区开展病例对照研究，通过整合转录组、蛋白组及代谢组学(multi-omics)分析血液标本，旨在表征高原肌少症患者循环免疫代谢(immunometabolic)谱，并筛选与肌肉力量相关的候选循环生物标志物，经细胞及动物模型验证其表达变化。

主要关键技术方法：

研究人员建立昆明(海拔2000 m)中老年前瞻性队列，按2019年亚洲肌少症工作组(Asian Working Group for Sarcopenia, AWGS2019)标准纳入肌少症组(n=60)及年龄、性别匹配的非肌少症对照组(n=60，含骨质疏松阳性亚组n=35及健康阴性亚组n=25)。采集外周血，分别进行：(1)转录组RNA-seq及加权基因共表达网络分析(weighted correlation network analysis, WGCNA)与基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)；(2)数据非依赖采集液相色谱-质谱(data independent acquisition liquid chromatography-tandem mass spectrometry, DIA LC-MS/MS)蛋白组学及蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络分析；(3)非靶向代谢组学及代谢物-基因相关性分析；(4)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)定量血清CD14和LRG1；(5)D-半乳糖(D-galactose, D-gal)诱导C2C12成肌细胞衰老模型，行qRT-PCR及Western blot检测FCGR2A、CD14、LRG1表达；(6)8月龄快速老化小鼠倾向株(senescence-accelerated mouse prone 8, SAMP8)与抗性株(senescence-accelerated mouse resistant 1, SAMR1)对照，行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色测肌纤维横截面积(cross-sectional area, CSA)及免疫荧光(immunofluorescence, IF)检测标志物表达。

3. Results（结果）

3.1. Patient characteristics（受试者基线特征）

经AWGS2019标准诊断分组后比较，肌少症组体重、BMI及腰围显著低于两对照组(P＜0.05)；男性肌少症组ASMI低于骨质疏松对照组(P=0.017)，女性肌少症组ASMI低于健康对照组(P=0.024)；女性肌少症组握力(handgrip strength, HGS)显著低于两对照组(P＜0.05)，男性握力组间差异未达显著性。组间年龄、身高、高血压、糖尿病等无显著差异，提示匹配良好。

3.2. Transcriptomics profiling（转录组学分析）

与阳性及阴性对照组比，肌少症组分别检出168和204个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)。GSEA显示肌少症者IL-6-JAK-STAT3及TNFα-NF-κB通路激活，肌细胞骨架及运动蛋白通路受抑。WGCNA锁定brown模块与肌少症/骨质疏松最相关，富集于NF-κB信号及细胞因子-细胞因子受体相互作用；取模块与DEGs交集做PPI网络，获119个互作蛋白，为后续蛋白组整合提供靶点。

3.3. Proteomics profiling（蛋白质组学分析）

与两对照组比肌少症组分别检出188和191个差异表达蛋白(differentially expressed proteins, DEPs)，富集于p38 MAPK、PI3K/Akt、NF-κB、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)及氧化磷酸化通路。将DEPs与前述PPI网络取交集，确定三个关键上调蛋白：FCGR2A（Uniprot P12318）、CD14（P08571）及LRG1（P02750），其对应mRNA在肌少症组亦显著升高(P＜0.05)。

3.4. Untargeted metabolomics profiling（非靶向代谢组学分析）

肌少症组差异代谢物主要涉及鞘脂(sphingolipid, SP)、甘油磷脂(glycerophospholipid, GP)、氨基酸及脂肪酸类等，其中鞘氨醇碱(sphinganine)、植物鞘氨醇(phytosphingosine)及精氨酰-丙氨酸(arginyl-alanine)在两组比较中趋势一致。相关性分析显示LRG1基因与甘油脂质甘油1-(5-羟基十二烷酸)[glycerol 1-(5-hydroxydodecanoate)]最相关，FCGR2A与乙酰肉碱ACar(10:1)最相关，CD14与磷脂酰乙醇胺phosphatidylethanolamine (PE)(10:0/26:4)最相关。

3.5. Biomarkers were upregulated in clinical and experimental Sarcopenia（生物标志物在临床样本及实验模型中上调）

ELISA证实肌少症组血清CD14和LRG1浓度均显著高于对照组(P＜0.05)，无性别交互效应。男性中CD14(rs=0.452)和LRG1(r=0.45)与HGS呈弱正相关且有统计学意义(P＜0.05)。C2C12细胞D-gal衰老模型中FCGR2A、CD14、LRG1的mRNA显著上调，WB仅LRG1蛋白显著升高。8月龄SAMP8小鼠比SAMR1小鼠腓肠肌(gastrocnemius, GA)及胫骨前肌(tibialis anterior, TA)肌纤维CSA显著减小(P＜0.05)，层粘连蛋白α1(laminin α1, LAMA1)表达下调，而CD14、FCGR2A及LRG1的肌肉组织IF信号显著增强(P＜0.05)，与多组学预测一致。

讨论与结论总结

讨论指出本研究首次在高海拔人群中通过整合多组学揭示肌少症伴随循环炎症-免疫-代谢通路失调（NF-κB、TLR、MAPK、PI3K-Akt等），与低海拔研究有部分重叠但具高原人群特征。CD14为TLR4共受体介导MyD88/TRIF→NF-κB活化促炎；FCGR2A为Fcγ受体II-a促进炎性细胞因子产生；LRG1可通过TGF-β通路激活MAPK/PI3K-Akt加剧炎症与凋亡，三者可能协同通过慢性炎症促进肌蛋白降解。代谢组中鞘脂及甘油磷脂异常亦与肌少症相关，且CD14与特定磷脂显著相关，提示脂质介导的炎症清除机制参与疾病进程。研究局限性包括单中心高海拔设计无低海拔对照、D-gal细胞模型无法模拟全身微环境，需更大独立队列验证。

结论翻译：综上所述，本研究对高原中老年人肌少症进行了整合多组学分析。LRG1、FCGR2A和CD14被确定为与该人群循环免疫代谢谱相关的关键分子。这些发现为高原人群肌少症的分子特征提供了探索性证据，并突出了值得在更大队列中进一步验证的潜在候选循环标志物。