一个具有内源性破骨细胞生成的完全人源工程化骨微环境揭示前列腺癌细胞中依赖破骨细胞的成骨样模拟

《Advanced Healthcare Materials》：A Fully Human Engineered Bone Niche With Endogenous Osteoclastogenesis Reveals Osteoclast-Dependent Osteomimicry in Prostate Cancer Cells

　　

骨是晚期前列腺癌（PCa）转移的主要部位，然而调控肿瘤-骨相互作用的机制仍未完全阐明，部分原因在于相关模型的缺乏。破骨细胞在此类相互作用中的作用尤其不清楚。研究人员开发了一种模块化的人源三维（3D）体外骨微环境模型，该模型将成骨细胞和破骨细胞整合在矿化支架内，重建了一个骨内膜样微环境，用于与PCa细胞系和患者来源类器官（PDOs）共培养。该工程化构建体维持了成骨分化并支持破骨细胞生成，通过包括骨钙蛋白、骨桥蛋白（OPN）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）在内的谱系标志物得以确认。与PCa细胞共培养下调了骨细胞中的成骨细胞和破骨细胞相关基因（IBSP、OPN、TRAP），提示肿瘤介导的骨重塑抑制。相反，共培养的PCa细胞表现出微环境依赖的成骨样模拟，其特征是成骨细胞标志物（SPARC、BGLAP）和破骨细胞标志物（TRAP）的上调，并受到破骨细胞存在的强烈调控。该平台还支持PDOs的植入和增殖，无需外源性PCa特异性生长因子，凸显了其转化应用价值。该成骨-破骨微环境模型提供了一个人源系统，能够在临床相关背景下捕捉PCa-骨细胞的相互作用，具有用于机制研究和转化研究的潜在价值。

**论文解读文章**

**研究背景**
前列腺癌（PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一，骨是其最主要的转移部位（占82%）。一旦发生骨转移，患者生存质量显著下降，现有治疗手段有限。骨转移过程中，肿瘤细胞与骨微环境中的成骨细胞和破骨细胞相互作用，破坏骨形成与骨吸收的动态平衡。然而，目前对破骨细胞在PCa骨转移中具体作用的认识仍不充分，主要原因是缺乏能够同时包含成骨细胞和破骨细胞的人源体外模型。现有模型多为动物来源或仅含成骨细胞，忽略了破骨细胞在早期转移定植、基质衍生生长因子释放及成骨细胞活性调控中的关键作用。因此，构建一个能同时支持成骨细胞和破骨细胞分化、并允许与PCa细胞共培养的人源三维骨微环境模型，对于揭示肿瘤-骨相互作用的机制至关重要。

**研究内容与结论**
研究人员开发了一种完全人源的模块化三维体外骨微环境模型，将骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）来源的成骨细胞和外周血CD14⁺单核细胞来源的破骨细胞整合在羟基磷灰石支架（Engipore）上，通过维生素D₃（而非外源性RANKL）刺激破骨细胞生成，构建了双细胞谱系（成骨-破骨）的骨微环境。该模型用于与PCa细胞系（LNCaP、PC3）及患者来源类器官（PDOXO）进行共培养。研究表明，该工程化微环境成功模拟了骨内膜微环境的关键特征：成骨细胞分化标志物（骨钙蛋白、骨桥蛋白、整合素结合唾液蛋白）表达维持，破骨细胞标志物（抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP）显著上调，且存在多核TRAP⁺细胞。共培养后，PCa细胞下调了骨细胞中成骨/破骨相关基因（IBSP、BGLAP、TRAP、OPN），尤其是PC3细胞导致了更显著的破骨基因抑制；同时，PCa细胞自身表现出微环境依赖的成骨样模拟，即骨样表型获得，包括成骨标志物（SPARC、BGLAP）和破骨标志物（OPN、TRAP）的上调，且该效应在含破骨细胞的微环境中更为显著。此外，该模型成功支持了患者来源类器官的植入和短期培养（10天），无需外源性器官样培养基，且类器官细胞表达骨相关标志物，重现了临床样本中的成骨样模拟表型。该论文发表在《Advanced Healthcare Materials》。

**主要关键技术方法**
（1）三维支架工程：采用羟基磷灰石-β磷酸三钙复合支架（Engipore，模拟松质骨孔隙率和无机成分），通过先后接种BM-MSCs和CD14⁺单核细胞，经成骨诱导培养基和含维生素D₃及巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的破骨诱导培养基序贯培养，构建双谱系骨微环境。
（2）体外共培养模型：将荧光标记的PCa细胞系（mEmerald-LNCaP、mCherry-PC3）或患者来源类器官（来自肺转移灶的PDOXO P20-11）直接接种于工程化微环境，在破骨培养基中共培养4天和10天，通过流式细胞分选（FACS）从支架中分离肿瘤细胞进行基因表达分析。
（3）分子与影像表征：采用qRT-PCR（TaqMan探针法）检测骨相关基因（IBSP、BGLAP、BMP2、ALPL、OPN、TRAP、SPARC），结合免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）对石蜡切片和整装标本进行蛋白表达定位，使用共聚焦显微镜和全切片扫描成像，并通过病理专家确认细胞形态。

**研究结果**
**2.1 工程化微环境重演骨微环境的成骨和破骨特征**
通过qRT-PCR和免疫组化证实：成骨标志物（ALPL、BMP2、IBSP、骨钙蛋白）在成骨-破骨微环境（OBCN）和仅成骨微环境（OBN）中均有表达，但OBCN中BGLAP表达下调，IBSP呈供体依赖性变化；破骨标志物OPN和TRAP在OBCN中显著上调（TRAP升高>264倍），并观察到多核TRAP⁺细胞。表明OBCN成功支持成骨细胞和破骨细胞共存与分化。

**2.2 OBCN支持前列腺癌细胞植入**
FACS和H&E/免疫荧光显示：LNCaP和PC3细胞均可植入OBCN，PC3细胞回收率略高于LNCaP；LNCaP形成紧密圆形团簇，PC3呈扁平分散状生长，E-钙黏蛋白表达较弱。扫描电镜进一步证实上皮细胞与破骨前体细胞共定位。

**2.3 PCa细胞系差异性地下调OBCN中破骨基因表达**
IHC显示共培养后骨标志物蛋白表达水平无明显变化；但qRT-PCR表明，PC3共培养显著抑制了非肿瘤骨细胞中OPN和TRAP的表达（约6.5至13倍），而LNCaP效应较温和且不显著。成骨基因（IBSP、BGLAP、BMP2）呈现供体依赖性变化，总体倾向于下调。

**2.4 破骨细胞存在增强前列腺癌细胞的破骨基因特征**
与2D培养对照相比，在OBN和OBCN中培养的PCa细胞均上调了成骨和破骨标志物。尤其值得注意的是，仅在OBCN条件下，PC3细胞中OPN和TRAP表达强烈上调（OPN升高68-2700倍，TRAP从不可检测变为高表达）；LNCaP细胞在OBCN中TRAP表达也显著高于OBN。SPARC在两种细胞中均上调，但无OBN/OBCN差异。表明破骨细胞特异性地增强了PCa细胞的破骨样模拟。

**2.5 患者来源类器官在OBCN中成功植入并表现成骨样模拟**
PDOXO（P20-11）细胞在OBCN中能够附着、增殖并形成簇状聚集体，10天后平均聚集体体积显著增加（Mann-Whitney U检验，p=6.2×10^?10）。免疫荧光显示，这些细胞表达细胞角蛋白-8（CK8）的同时也表达骨钙蛋白、TRAP和骨桥蛋白，与临床骨转移样本中的表达模式一致。而在无骨细胞的支架或Matrigel中单独培养时，类器官无法存活。

**总结与讨论**
该研究构建了一个完全人源、模块化的三维骨转移微环境模型，首次在体外通过内源性成骨-破骨细胞轴支持PCa细胞系和患者来源类器官的共培养。研究证实破骨细胞的存在对PCa细胞获得破骨样表型（成骨样模拟）具有关键调控作用，并揭示了PCa细胞对骨细胞基因表达的反馈抑制。该模型可捕捉早期肿瘤-骨交互特征，支持患者样本的短期培养，为个性化药物测试和机制研究提供了平台。研究结论部分指出：“本研究呈现了一个完全人源的、工程化的骨内PCa转移模型，支持与永生化细胞系和患者来源类器官的共培养。该模型再现了转移早期建立的关键特征，包括骨微环境表型改变及肿瘤细胞中双谱系（成骨和破骨）成骨样模拟的诱导。其与患者来源材料的兼容性突显了其在个性化药物测试和肿瘤-微环境相互作用机制研究中的潜在应用。”局限性包括未直接验证破骨细胞功能活性（如骨吸收）、共培养时间较短（10天），未来需引入功能测定和延长培养周期。