呼吸道合胞病毒基于废水的测序以研究谱系动态和抗原位点突变：一项回顾性基因组流行病学研究

《The Lancet Microbe》：Wastewater-based sequencing of respiratory syncytial virus to investigate lineage dynamics and antigenic site mutations: a retrospective genomic epidemiology study

　　

背景：呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染对临床脆弱人群（如婴幼儿和老年人）构成重大健康负担。尽管新型免疫预防干预措施在提供保护方面显示出前景，但许多国家可能缺乏强有力的监测系统来监控流行的RSV谱系并检测可能降低这些新干预措施有效性的突变。本研究旨在通过基于扩增子的测序（amplicon-based sequencing）和废水提取物分析，评估城市人群中流行RSV谱系的多样性和时间动态。方法：在这项前瞻性观察性基于废水的基因组监测研究中，在2022–23和2023–24 RSV流行季节，从瑞士苏黎世和日内瓦各采集了32份24小时复合原污水样品。研究人员应用RSV亚型特异性基于扩增子的测序方法，从所有64份样品中获取RSV-A和RSV-B序列。在读段深度超过30的位点鉴定相对于参考基因组的突变。通过谱系特征突变（lineage-signature mutations）的频率（该突变存在于该谱系公开序列的90%以上）估计RSV谱系的相对丰度。结果：在两个RSV流行季节中，估计了RSV-B（2022-23）和RSV-A（2023-24）谱系的相对丰度。在2022–23季节，RSV-B B.D.E.1谱系在两个城市均占主导。在2023–24季节，多个RSV-A谱系共同流行，包括A.D.1、A.D.3、A.D.5及其亚谱系。突变的鉴定和频率估计显示，在RSV-A和RSV-B的融合（fusion，F）基因抗原位点上存在低频非同义突变，其中一些尚未在临床序列中报道。主要结果是在废水样品中鉴定RSV谱系及其相对丰度。解释：这些发现显示了基于废水的基因组监测在识别和追踪流行RSV谱系及临床相关突变方面的潜力。随着新型RSV免疫预防措施在即将到来的RSV流行季节中引入，基于废水的RSV基因组数据为了解RSV多样性和未来在免疫压力增加下的病毒进化提供了有价值的基线。

以下是对论文《呼吸道合胞病毒基于废水的测序以研究谱系动态和抗原位点突变：一项回顾性基因组流行病学研究》的解读文章。

**研究背景、问题与研究目的**

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是常见的呼吸道病原体，通常引起轻微感冒样症状，但在临床脆弱人群（如婴幼儿和老年人）中可发展为严重呼吸道疾病，导致住院和死亡，给全球医疗系统带来沉重负担。自2023年起，新型RSV疫苗和长效单克隆抗体（如nirsevimab）已显示出减少RSV相关下呼吸道感染住院的疗效，并在多个国家获批。然而，许多国家缺乏强有力的监测系统来追踪流行的RSV谱系和检测可能降低这些新干预措施有效性的突变。当前RSV感染监测通常依赖临床医生的自愿病例报告，且常规检测主要针对医院和养老机构中的临床脆弱人群，导致监测系统不完整且偏向重症病例，对普通人群的病毒流行情况认知不足。基于废水的监测（wastewater-based surveillance）已被证明可有效追踪主要公共卫生病原体，提供独特的人群水平病原体流行和传播信息。已有研究表明，废水RSV浓度与临床报告病例趋势密切吻合，支持其作为监测方法的可靠性。尤其在临床监测不足的地区，基于废水的监测可为追踪RSV季节性和指导免疫规划时机提供宝贵资源。新型RSV疫苗的引入凸显了除监测RNA浓度外，进行RSV基因组监测以追踪流行毒株和潜在疫苗耐药突变的重要性。RSV分为两种主要抗原亚型（RSV-A和RSV-B），通常每1-2个季节交替占主导。以往研究主要基于表面糖蛋白（glycoprotein，G）基因测序进行基因型鉴定，或尝试全基因组测序但覆盖率有限，未能实现谱系追踪或检测临床相关突变。本研究旨在开发一种基于扩增子的方法，从废水中进行RSV全基因组测序，评估其能否可靠检测和追踪RSV谱系及融合（fusion，F）基因突变，为传统临床监测提供补充。

**研究方法与结论**

本研究为前瞻性观察性基于废水的基因组监测研究。在2022–23和2023–24两个RSV流行季节，从瑞士苏黎世（服务471,000人）和日内瓦（服务454,000人）的污水处理厂各采集了32份24小时复合原污水样品，共计64份。采用基于扩增子的RSV亚型特异性测序方法，首先通过逆转录和cDNA合成，然后使用50对（RSV-A）或51对（RSV-B）引物组扩增全基因组，产生400 bp片段，并在NextSeq2000或AVITI平台上进行250 bp双端测序。使用V-pipe计算管道进行生物信息学分析，包括修剪、比对、突变调用（读段深度>30）。通过Lollipop软件，基于谱系特征突变（在公开序列中该谱系出现频率≥90%）的频率反卷积出谱系相对丰度。研究还利用基于废水的RSV监测计划中获得的7天中值流量归一化总RSV病毒载量，按比例计算谱系绝对丰度。统计学分析采用指数饱和曲线和Spearman相关评估基因组覆盖率与RNA浓度的关系。

**研究结果**

**基因组覆盖率：** 2022-23季节的废水样品（n=28）主要测序RSV-B，获得中位基因组覆盖率88%（范围36-96%），F基因中位覆盖率96%（范围13-100%）。2023-24季节的样品（n=36）主要测序RSV-A，获得中位覆盖率62%（范围0-91%），F基因中位覆盖率62%（范围0-100%）。全基因组覆盖率与RSV总浓度呈显著正相关（RSV-A：Spearman ρ=0.69，p<0.0001；RSV-B：ρ=0.42，p=0.027）。

**RSV-B谱系动态（2022-23季节）：** 大多数RSV-B突变频率随时间和地点一致，非同义突变主要对应B.D.E.1谱系的特征突变。通过特征突变反卷积显示，B.D.E.1在苏黎世和日内瓦整个2022-23季节中均占主导，相对丰度持续高于94%。次要谱系B.D.4.1.1仅零星出现，相对丰度低于5%。

**RSV-A谱系动态（2023-24季节）：** 核苷酸替换在时间和地点上一致，大多数突变与同期瑞士临床样品中流行的RSV-A谱系重叠。特征突变反卷积显示多个RSV-A谱系共同流行：A.D.5亚谱系在季节早期占主导，在日内瓦相对丰度峰值达98%（95% CI 97-100%），苏黎世92%（84-98%）（11月中下旬）；A.D.1在季节末期占主导，2月苏黎世峰值74%（22-98%），日内瓦99%（98-99%）；A.D.3在整个季节中以不同相对丰度共同流行，苏黎世范围为6%（1-14%）至92%（8-99%），日内瓦0至37%（17-51%）。A.D.1的相对丰度模式在两城市相似，但A.D.5和A.D.3的丰度模式不一致。

**F基因抗原位点突变：** RSV-B F基因突变与B.D.E.1谱系特征一致，高频氨基酸替换S190N、S211N和S389P在整季中持续观察到。此外，还检测到低频非同义突变（频率>0.02），包括F12I、R42K、R209Q、I431L和T555A。其中F12I在瑞士4/8公开RSV-B序列中出现（均属B.D.E.1）；R42K和R209Q未在同期瑞士临床序列中出现，但存在于全球临床样本；I431L未在任何临床序列中发现。RSV-A F基因突变对应A.D.1、A.D.2、A.D.3和A.D.5及其亚谱系的特征突变。低频非特征突变包括L20I、A23T、T91R、A103T、M115T、S377N和A518V，其中除T91R外均在全球临床序列中发现。S377N位于抗原位点III，是RSVPreF3（AREXVY）疫苗的靶点。

**讨论与结论总结**

研究结果表明，基于废水的基因组监测能够可靠地检测和追踪RSV谱系动态及F基因中已知和未知的临床相关突变。在2022-23季节，瑞士废水主要检测到RSV-B，且B.D.E.1谱系占主导，这与COVID-19大流行后RSV-B驱动的流行病趋势一致。2023-24季节，废水显示RSV-A更高的基因组多样性，多个谱系共同流行（A.D.1、A.D.3和A.D.5相关谱系），与同期临床数据相符。F基因突变检测中，部分低频非同义突变（如R42K、I431L等）在临床序列中罕见或未见，表明废水测序能识别可能被临床监测遗漏的局部流行亚谱系，这些突变可能影响F蛋白抗原位点，对免疫预防策略具有潜在临床意义。研究结论强调，基于废水的基因组监测可作为临床监测的成本效益补充，为即将推出的新型RSV免疫预防干预措施提供实施前的基线数据。未来可通过优化废水浓缩和提取方法、长读长测序等提高基因组覆盖率和减少对临床序列的依赖。尽管存在不能溯源个体、短扩增子无法重建完整病毒基因组、低浓度样本覆盖率低等局限，但本研究首次证明了从废水进行常规RSV全基因组监测的可行性，填补了现有临床和部分基因组方法无法解决的监测空白。将废水监测与现有临床监测系统整合，有助于早期检测疫苗逃逸毒株，指导RSV疫苗和抗体类药物持续优化。