工程化纳米桥接策略通过STING通路激活重塑食管鳞状细胞癌的免疫微环境

《MedComm》：An Engineered Nano-Bridging Strategy Remodels the Immune Microenvironment of Esophageal Squamous Cell Carcinoma via STING Pathway Activation

　　

恢复巨噬细胞介导的吞噬作用是一种增强抗肿瘤先天免疫的有前景的策略。然而，食管鳞状细胞癌（ESCC）高度免疫抑制的肿瘤免疫微环境（TIME）限制了巨噬细胞浸润，损害效应功能，并制约了对免疫治疗的持久反应。在此，研究人员开发了一种多功能纳米平台HA1@diABZI–HMGB1，整合了ESCC靶向适配体HA1、损伤相关分子模式蛋白HMGB1和STING激动剂diABZI，通过协调免疫调节来重塑TIME。在该系统中，HA1旨在改善肿瘤细胞识别和肿瘤部位积累，而HMGB1被引入以促进巨噬细胞-肿瘤细胞相互作用并促进吞噬参与。同时，diABZI的细胞内递送激活了STING信号传导，增强了促炎细胞因子的产生，并促进了肿瘤相关巨噬细胞向M1样表型的复极化。在ESCC模型中，HA1@diABZI–HMGB1增强了巨噬细胞吞噬作用，减少了M2样巨噬细胞积累，增加了树突状细胞成熟，促进了细胞毒性T淋巴细胞浸润，并在无明显全身毒性的情况下抑制了肿瘤进展。机制上，这种整合策略将肿瘤靶向锚定、免疫细胞桥接和先天免疫激活结合在一个单个纳米系统中。总之，这些发现支持该纳米平台在临床前水平重塑ESCC免疫微环境的潜力，并为进一步研究以巨噬细胞为中心的免疫调节策略提供了基础。

食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种高度致命的胃肠道恶性肿瘤，患者5年生存率低于20%，尽管免疫检查点抑制剂改善了治疗格局，但ESCC高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）导致多数患者免疫耐受或无应答。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是ESCC微环境中最丰富的浸润免疫细胞，其M2样表型通过分泌抑制性细胞因子、诱导血管生成和抑制T细胞毒性构成免疫屏障，而M1样巨噬细胞能支持炎症反应和抗原递呈。cGAS–STING通路可连接先天免疫与适应性免疫，激活后能诱导I型干扰素（IFN-I）反应并促进巨噬细胞向M1极化，但小分子STING激动剂如diABZI存在肿瘤积累不足、细胞内递送效率低、全身清除快和脱靶毒性等问题，尤其对于ESCC这类“免疫冷”肿瘤，单独STING激活难以克服免疫逃逸机制。为此，研究人员开发了一种多功能纳米平台HA1@diABZI–HMGB1，旨在通过“物理桥接”和“生化激活”双重机制重塑ESCC免疫微环境，该研究成果发表在《MedComm》。

开展研究用到的主要关键技术方法包括：采用Cell-SELEX技术从随机ssDNA文库中筛选出对小鼠ESCC细胞（mEC25）具有高亲和力的核酸适配体HA1；通过蛋黄脂质提取制备脂质纳米颗粒（EYLNs）并封装diABZI，利用聚乙烯亚胺（PEI）静电锚定HA1，再通过铜自由点击化学将DBCO修饰的HMGB1与叠氮功能化脂质连接，组装成最终纳米颗粒；体外使用BMDMs（C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞）与mEC25共培养体系评估吞噬和极化；体内采用C57BL/6小鼠皮下mEC25肿瘤模型进行生物分布、疗效和免疫分析。

**2.1 ESCC靶向适配体HA1的筛选与验证**：通过Cell-SELEX对小鼠ESCC细胞（mEC25）进行20轮筛选，获得候选适配体HA1，流式细胞术测得与mEC25的结合解离常数（Kd）为37.59±19.29 nM，共聚焦显微镜验证HA1选择性识别mEC25而非4T1、CT26、MC38等其他肿瘤细胞，小鼠体内近红外成像显示HA1在肿瘤部位选择性富集。

**2.2 多功能桥接纳米颗粒HA1@diABZI–HMGB1的仿生设计与构建**：优化EYLNs与diABZI的摩尔比为20:0.125（质量比3 mg:22.15 μg）以保持稳定分散；琼脂糖凝胶电泳证实HA1与脂质体表面结合；SDS-PAGE和银染确认HMGB1通过点击化学成功修饰；透射电镜（TEM）显示均匀球形结构；共聚焦显微镜观察到纳米颗粒促进BMDM与mEC25细胞接触。

**2.3 HA1@diABZI–HMGB1的理化表征**：动态光散射（DLS）显示HA1@diABZI–HMGB1水合粒径较EYLNs–diABZI略有增加，zeta电位负移约10 mV；HPLC测定diABZI包封率超过90%；在pH 7.4和5.5条件下均持续释放，酸性环境加速释放；在PBS和含10% FBS的PBS中4°C和37°C下7天内粒径稳定。

**2.4 HA1@diABZI–HMGB1对巨噬细胞吞噬和免疫表型的调节**：流式细胞术和共聚焦显微镜显示HA1@diABZI–HMGB1显著增强BMDM对CFSE标记mEC25的吞噬（CFSE⁺CD11b⁺比例升高），该效果部分依赖TLR4和RAGE受体（抑制实验证实）；处理BMDM后CD86表达上调，在IL-4/IL-13诱导的M2样BMDM中，M1/M2表型比值从0.06升至16.16；Transwell共培养中，HA1@diABZI–HMGB1组肿瘤细胞增殖最受抑制。

**2.5 HA1@diABZI–HMGB1激活STING通路并诱导促炎细胞因子分泌**：Western blot显示相对等剂量游离diABZI和EYLNs–diABZI，HA1@diABZI–HMGB1更显著诱导STING、TBK1和IRF3磷酸化；在BMDM-mEC25共培养上清中，IFN-β、IL-6、TNF-α、CXCL10水平显著升高；STING抑制剂H-151可抑制HA1@diABZI–HMGB1诱导的M2向M1复极化。

**2.6 HA1和HMGB1协同增强体内生物分布和循环稳定性**：在mEC25荷瘤小鼠中，HA1@diABZI–HMGB1在注射后1-24小时肿瘤荧光信号持续高于其他配方，离体成像确认肿瘤积累增强；外周血荧光监测显示HA1@diABZI–HMGB1在各时间点血药浓度最高，提示血液循环稳定性改善。

**2.7 HA1@diABZI–HMGB1的体内抗肿瘤疗效**：在mEC25皮下模型（肿瘤体积200-300 mm³）中静脉给药5次，HA1@diABZI–HMGB1组肿瘤生长抑制最强，肿瘤重量最低；H&E染色显示大面积核固缩和组织崩解，Ki67阳性率降低，TUNEL阳性凋亡信号增加。

**2.8 HA1@diABZI–HMGB1重塑TIME并激活系统性抗肿瘤免疫**：流式分析肿瘤浸润免疫细胞显示，HA1@diABZI–HMGB1组M1样巨噬细胞比例从11.5%升至57.2%，成熟DC（CD86⁺）显著增加，CD8⁺ T细胞浸润增多，调节性T细胞（Tregs）从40%降至5.19%，髓系来源抑制细胞（MDSCs）从71.0%降至12.0%；脾脏中M1巨噬细胞、DC和CD8⁺ T细胞比例升高，MDSC降低，效应记忆T细胞（Tem, CD44^hiCD62L^low）显著增加；血清中IFN-β、IFN-γ、IL-6、TNF-α、CXCL10水平升高。

**2.9 HA1@diABZI–HMGB1的生物安全性**：体外溶血率在400 μg/mL下低于2%；治疗期间体重稳定增长；治疗结束后血常规和肝肾功能指标（ALT、AST、AKP、CRE、BUN）与PBS组无显著差异；心、肝、脾、肺、肾H&E染色未见组织损伤或炎性浸润。

**讨论与结论**：讨论指出，该研究通过构建纳米平台HA1@diABZI–HMGB1整合“靶向锚定、物理桥接和免疫激活”，以“桥接-激活”策略缓解实体瘤中巨噬细胞吞噬的空间限制，并通过STING/TBK1/IRF3通路协同活化支持ESCC免疫微环境的多维重塑。尽管在临床前模型中显示出疗效，但纳米颗粒的长期命运、与异质性巨噬细胞亚群的相互作用、HMGB1介导NF-κB通路的潜在贡献以及不同ESCC分子亚型中的适用性仍需进一步研究。结论翻译为：总之，本研究开发了一种纳米免疫调节剂HA1@diABZI–HMGB1，整合了“靶向锚定、物理桥接和免疫激活”。通过采用“桥接-激活”策略，该平台可能减轻实体瘤中巨噬细胞的吞噬限制，并支持ESCC免疫微环境的多维调节，其机制涉及STING/TBK1/IRF3通路的协同激活和巨噬细胞介导的免疫应答增强。这些发现表明HA1@diABZI–HMGB1是解决ESCC免疫耐药的一种有前景的组合策略，并可能为实体瘤治疗中协调先天免疫和适应性免疫提供有用的框架。