《Materials Today Advances》：Enhanced endosomal escape for nanoparticle-enabled co-delivery of doxorubicin and siRNA to overcome multidrug resistance
编辑推荐：
尽管小分子化疗药物与小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)的共递送是联合治疗的一种有前景的平台策略，但现有递送系统无法实现高效的胞内体逃逸(endosomal escape)，限制了胞质内siRNA的生物可利用度与治疗效力。常
尽管小分子化疗药物与小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)的共递送是联合治疗的一种有前景的平台策略，但现有递送系统无法实现高效的胞内体逃逸(endosomal escape)，限制了胞质内siRNA的生物可利用度与治疗效力。常规脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle, LNP)虽可共包封化疗药与siRNA，但其胞内体逃逸效率低导致siRNA生物可利用度不足。本研究报道一种新型球状纳米颗粒(sphere-like nanoparticle, SNP)平台，用于siRNA与小分子药物的共递送以克服上述局限。该系统中，阿霉素(doxorubicin, DOX)嵌入Janus碱基纳米管(Janus base nanotube, JBNt)结构中，siRNA通过静电相互作用被包封，实现稳定的共装载。值得注意的是，SNP较脂质纳米颗粒表现出显著增强的胞内体逃逸能力，其依托JBNt本身的质子海绵(proton-sponge)缓冲容量介导胞内体逃逸，从而促进两种 cargo高效协同地递送至细胞质。概念验证研究表明，SNP介导的多药耐药蛋白1基因(Multidrug Resistance 1 gene, MDR1/ABCB1)靶向siRNA与DOX共递送，可在癌细胞、肿瘤球及小鼠卵巢癌异种移植模型中有效沉默基因并增强凋亡。综上，本研究证明SNP可作为共递送RNA与化疗药物以克服化疗耐药、提升抗癌疗效的有前景的共递送平台。
研究背景与意义
虽然小分子化疗药物与小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)的共递送是癌症联合治疗的有前景策略，可实现同时调控致病通路与直接细胞毒作用，但siRNA-based联合疗法的临床转化受限于RNA分子本身易被核酸酶降解及细胞内递送效率低下，其中胞内体扣押(endosomal entrapment)是最关键的障碍——有效的RNA干扰(RNA interference, RNAi)要求RNA cargo从胞内体/晚期内体逃逸入细胞质，避免溶酶体降解。现有递送平台包括脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle, LNP)和阳离子聚合物通常胞内体逃逸效率有限，绝大部分被内吞的siRNA滞留于内体/溶酶体中失去功能。因此亟需既能实现核酸与小分子药物稳定共包封，又能高效胞内体逃逸的递送系统。研究人员此前证明Janus碱基纳米管(Janus base nanotube, JBNt)——一种由自组装核碱基单元构成的DNA模拟纳米结构——可通过质子海绵(proton-sponge)介导的胞内体逃逸增强siRNA递送且细胞毒性低，但早期制剂未设计支持小分子治疗药物与siRNA的协调胞内共递送（二者亚细胞转运与释放动力学差异会限制联合疗效）。本研究在此基础上开发源自JBNt的球状纳米颗粒(sphere-like nanoparticle, SNP)，用于siRNA与小分子化疗药的双 cargo 共递送，利用JBNt的胞内体逃逸能力在同一纳米载体中实现协同递送。以MDR1(编码P-糖蛋白P-glycoprotein, P-gp)介导的多药耐药(multidrug resistance, MDR)为概念验证模型——MDR1过表达导致蒽环类耐药，共递送MDR1靶向siRNA与阿霉素(doxorubicin, DOX)可同时抑制P-gp表达并恢复细胞内药物蓄积。本研究论文发表于《Materials Today Advances》。
关键技术方法
研究人员采用Janus碱基单体与DOX通过π–π堆积作用嵌合形成JBNt–DOX，再与siRNA通过静电相互作用混合后经超声处理制备SNP–DOX–siRNA；通过透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)、琼脂糖凝胶迁移实验(gel shift assay)、ζ电位、紫外–可见吸收光谱(UV–Vis)表征纳米颗粒形貌、粒径、电位、包封与稳定性；以人卵巢癌细胞系SKOV-3单层培养及SKOV-3三维肿瘤球为体外模型，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)、流式细胞术评估共递送效率与胞内体共定位（LysoTracker标记晚期内体/溶酶体），以Manders系数与Pearson相关系数定量胞内体逃逸；通过RT–qPCR、Western blot、Annexin V/PI凋亡检测、Caspase?3/7荧光染色评估MDR1基因沉默效果与凋亡诱导；建立SKOV-3皮下荷瘤裸鼠(NU/J小鼠)模型进行体内生物分布(离体荧光成像)与抗肿瘤疗效评价(肿瘤体积监测、免疫荧光cleaved caspase?3与TUNEL染色、主要脏器H&E染色、血常规CBC)。
研究结果
2.1. Synthesis and characterization of SNP–DOX–siRNA
JBNt嵌合DOX(JBNt–DOX)保持纳米管形貌，与siRNA静电复合后(JBNt–DOX–siRNA)仍保留管状结构，经超声处理后自组装为球状SNP–DOX–siRNA。凝胶迁移实验证实siRNA被有效包封；ζ电位显示SNP–DOX–siRNA表面电荷约+35 mV；UV–Vis光谱中DOX与JBNt混合后出现蓝移(hypsochromic shift)，表明DOX成功嵌入JBNt结构；siRNA加入后吸光度谱改变提示静电相互作用。SNP–DOX–siRNA在3天内特征吸收谱保持稳定，RiboGreen分析显示siRNA包封效率高，3天后仍有>80% siRNA保留于纳米颗粒内，表明制剂结构稳定、siRNA保留良好。
2.2. In vitro co?delivery of DOX and siRNA
在SKOV-3细胞中以不同JBNt氨基(N)与siRNA磷酸基(P)摩尔比(N/P比)处理，CLSM观察DOX(入核)与AF488标记siRNA(入胞质)共递送，流式细胞术显示N/P=47时共递送效率达92.2%，因此选定N/P=47用于后续体内外实验。
2.3. SNP–DOX–siRNA exhibited superior endosomal escape compared with conventional LNP
以LysoTracker Red标记晚期内体/溶酶体，CLSM显示SNP组AF488–siRNA绿色荧光弥散于胞质，与红色信号共定位少；LNP组绿色与红色强重叠。Manders共定位系数SNP组显著低于LNP组，Pearson相关系数(R值)SNP组显著低于LNP组，表明SNP依托JBNt的质子海绵效应实现更高效的siRNA胞内体逃逸，而LNP大部分siRNA滞留于晚期内体/溶酶体。
2.4. Co?delivery of DOX and siRNA enhanced apoptotic induction
RT–qPCR显示SNP–DOX–MDR1 siRNA组MDR1 mRNA显著低于SNP–DOX与阴性对照siRNA组，并下调抗凋亡BCL?2、上调pro?apoptotic Caspase?3 mRNA；Western blot与流式细胞术证实P?gp蛋白表达降低。Caspase?3/7染色与Annexin V凋亡检测显示SNP–DOX–MDR1 siRNA组早期凋亡细胞比例(40.7%)显著高于SNP–DOX单独处理组(15.1%)，表明MDR1沉默联合DOX协同增强凋亡。
2.5. Co?delivery of DOX and siRNA enhanced penetration and apoptosis in cancer spheroids
SNP–DOX–siRNA可随时间(24–96 h)渐进渗透至SKOV?3肿瘤球核心。Caspase?3/7染色显示SNP–DOX仅在外周诱导凋亡，SNP–DOX–MDR1 siRNA则在整个球体(含核心)显著增强Caspase?3/7活化；Annexin V检测晚期凋亡细胞比例SNP–DOX–siRNA组(35.7%)高于SNP–DOX组(18.2%)，证明该共递送系统在3D肿瘤模型中可有效穿透并诱导全层凋亡。
2.6. Antitumor efficacy of SNP?mediated co?delivery of DOX and siRNA
荷SKOV?3瘤裸鼠经尾静脉给药，离体荧光显示SNP–DOX–siRNA在肿瘤组织富集高于主要脏器。治疗实验(每6天给药共4次)中SNP–DOX–MDR1 siRNA组肿瘤生长显著受抑，终末瘤重明显低于生理盐水对照组；肿瘤冷冻切片cleaved caspase?3与TUNEL信号强于对照组。实验期间小鼠体重稳定，主要脏器H&E未见坏死或炎症，血常规各指标与基线比无显著变化，表明系统生物相容性良好。
讨论与结论总结
讨论部分指出：SNP平台通过JBNt的质子海绵效应缓解传统共递送系统的胞内体逃逸瓶颈，SNP–DOX–siRNA与LNP相比siRNA与晚期内体/溶酶体共定位显著降低，支持增强的胞内体逃逸与协调的双 cargo胞质/核递送；该共递送策略特别适用于MDR1高表达的耐药肿瘤如卵巢腺癌，通过siRNA沉默MDR1解除P?gp介导的DOX外排恢复药敏；双装载策略(先DOX嵌入后siRNA静电复合)实现单一载体共包封避免双载体药代不同步问题；球形SNP(aspect ratio≈1.6)仍可有效渗透3D肿瘤球，未来可优化长径比或表面修饰靶向配体(folate、iRGD等)进一步提升瘤内分布与靶向性。研究局限性包括仅在SKOV?3异种移植模型验证、体内实验缺游离DOX/SNP–DOX单独对照组未完全区分各组分贡献、LNP对照为Lipofectamine 2000而非临床离子化LNP、尚未做完整药代/免疫原性/长期毒性评价。
研究结论：本研究建立了源自JBNt的球状纳米颗粒(SNP)共递送平台，解决了常规纳米载体RNA疗法中胞内体逃逸效率低的核心问题。SNP–DOX–siRNA与LNP相比显著减少siRNA与内体/溶酶体共定位，支持siRNA高效胞质递送与DOX协调胞内递送。结果表明，基于JBNt胞内体逃逸技术的SNP共递送系统有望成为耐药实体瘤中化疗?RNA组合疗法的新平台。
