用于HER2阳性乳腺癌光热-动力(photothermal-dynamic)与化疗的多载荷抗体药物偶联物(Multi-payload Antibody-Drug Conjugate, ADC)

《Materials Today Bio》：Multi-payload Antibody-Drug Conjugates for Photothermal Dynamic and Chemotherapy of HER2-positive Breast Cancer

　　

摘要：HER2阳性乳腺癌因HER2蛋白过表达而侵袭性强、临床预后差。曲妥珠单抗(Trastuzumab)可显著改善HER2阳性乳腺癌疗效，但约70%患者产生耐药。曲妥珠单抗类抗体药物偶联物(Trastuzumab-based Antibody-Drug Conjugate, ADC)已成为HER2阳性乳腺癌有前景的治疗手段，但其疗效仍受限。本研究报道一种多载荷曲妥珠单抗偶联物QC-AA@Tra，通过将负载偶氮引发剂AIPH的NIR-II荧光团(Q3)经亲核取代反应连接至曲妥珠单抗制备而得。静脉给药后，QC-AA@Tra选择性富集于肿瘤部位；808 nm激光照射下，AIPH热释放氮气及自由基，QC-AA@Tra产生强效光热-动力(photothermal-dynamic, PTDT)效应。结合曲妥珠单抗靶向作用，该偶联物在小鼠HER2阳性BT474异种移植瘤模型中实现显著肿瘤抑制。该研究设计有望为HER2阳性恶性肿瘤的精准诊疗提供一种强效通用策略。

论文解读：《Materials Today Bio》发表于苏州大学研究团队开发的用于HER2阳性乳腺癌协同诊疗的多载荷抗体药物偶联物(multi-payload Antibody-Drug Conjugate, ADC)研究。

研究背景：乳腺癌是全球女性最常见恶性肿瘤，约20%–30%为HER2阳性(HER2-overexpressing)，侵袭性高、生长快。单克隆抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab, Tra)靶向HER2可抑制肿瘤细胞生长并改善患者预后，但约70%患者会产生原发或继发耐药。现有已上市ADC药物如Trastuzumab Deruxtecan(T-DXd)和Ado-Trastuzumab Emtansine(T-DM1)对HER2阳性乳腺癌有效，仍有约21%患者肿瘤抑制或缓解不佳，亟需开发更高效基于曲妥珠单抗的ADC。光热-动力治疗(photothermal-dynamic therapy, PTDT)将光热治疗(photothermal therapy, PTT)与化学动力学治疗(chemodynamic therapy, CDT)整合于单一体系，近红外(near-infrared, NIR)光转为热量及活性氧(reactive oxygen species, ROS)，且在肿瘤缺氧微环境中仍可产生活性自由基，优于传统光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)；但常用PTDT试剂多为纳米材料，存在代谢及安全隐患。研究人员此前发现NIR-II染料ZM1068具优良光热性质，其氯基团可在温和条件下与蛋白巯基发生亲核取代，适合作为ADC连接子。本研究旨在构建基于曲妥珠单抗、集NIR-II荧光成像、PTDT及化疗(曲妥珠单抗本身抑制作用)于一体的多载荷ADC，评估其体外体内抗肿瘤效果及靶向性。

主要关键技术方法：研究人员合成NIR-II荧光团Q3，通过点击化学反应接枝单-6-脱氧-6-叠氮-β-环糊精(β-cyclodextrin, β-CD)得Q3-CD；将含氯Q3-CD与曲妥珠单抗巯基经硫醇-氯亲核取代(S_N2)反应偶联得QC@Tra；合成金刚烷修饰的热敏偶氮引发剂Ad-AIPH，通过主客体包合及疏水作用载入QC@Tra的β-CD空腔得QC-AA@Tra。采用紫外-可见-近红外吸收光谱、荧光光谱、SDS-PAGE及基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)表征产物；以808 nm激光照射检测光热升温及电子自旋共振(electron spin resonance, ESR)检测自由基释放评价PTDT效应；以BT474(HER2阳性乳腺癌细胞)和HEK293(人胚肾细胞)为细胞模型，通过共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)、流式细胞术评价细胞摄取及靶向特异性；CCK-8法检测细胞毒性及半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)，Calcein AM/PI活死染色、DCFH-DA探针检测胞内ROS、Annexin V-FITC/PI双染流式检测凋亡；建立BALB/c裸小鼠BT474原位乳腺移植瘤模型，尾静脉注射QC-AA@Tra或对照后进行NIR-II活体荧光成像评估肿瘤富集，808 nm激光照射后监测瘤温、测量瘤体积及体重变化、取瘤及主要脏器行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, H&E)及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL)染色评估疗效及安全性，计算肿瘤抑制率(tumor inhibition rate, TIR)。

研究结果：

3.1. Design, synthesis and characterization of QC-AA@Tra

研究人员通过点击化学将β-CD接至Q3得Q3-CD，再经硫醇-氯亲核取代将Q3-CD偶联至曲妥珠单抗得QC@Tra，主客体包合Ad-AIPH得QC-AA@Tra。紫外吸收显示QC-AA@Tra在889 nm有最大吸收(较Q3红移约156 nm)，350 nm处增强峰证实Ad-AIPH成功负载；荧光光谱表明Q3-CD和QC-AA@Tra发射强NIR-II荧光，β-CD提高水溶性增强信号。SDS-PAGE显示Q3-CD可高效标记曲妥珠单抗，选定20:1(曲妥珠单抗:Q3-CD摩尔比)构建QC-AA@Tra。808 nm激光(1 W/cm², 10 min)下QC-AA@Tra溶液温度随浓度升高而上升，光热转换效率η约20.9%；ESR结合POBN自旋捕获剂及HPLC证实808 nm持续照射可稳定产生碳中心自由基，表明QC-AA@Tra具备PTDT应用潜力。

3.2. Affinity test of QC-AA@Tra for HER2-positive breast cancer

研究人员以相同浓度QC-AA@Tra与曲妥珠单抗分别处理BT474细胞8 h，流式结果无显著差异，表明QC-AA@Tra与天然曲妥珠单抗对HER2受体结合亲和力相当。BT474与HEK293细胞分别孵育QC-AA@Tra不同时间后，CLSM及流式细胞术显示BT474细胞荧光强度约为HEK293细胞的3.5倍(8 h时)，证明QC-AA@Tra对HER2阳性肿瘤细胞具良好靶向特异性及选择性摄取能力。

3.3. PTDT of QC-AA@Tra on BT474 breast cancer cells

研究人员以HEK293细胞评估QC-AA@Tra生物相容性，1000 nM孵育24 h细胞存活率>90%，对正常细胞无明显毒性。BT474细胞24 h孵育Tra及QC-AA@Tra均可抑制生长(曲妥珠单抗本身抗HER2化疗效应)。808 nm照射下QC-AA@Tra对BT474抑制更显著，IC₅₀为5.7 nM；QC-AA@Tra(含Ad-AIPH)比仅含Q3-CD的QC@Tra光杀伤效应更强。活死染色显示BT474死亡细胞远多于HEK293；DCFH-DA探针表明808 nm照射后胞内ROS水平与QC-AA@Tra摄取量正相关；Annexin V/PI凋亡检测显示QC-AA@Tra+808 nm(0.3 W/cm², 4 min)诱导BT474凋亡率62.9%，高于QC@Tra+808 nm组的40.3%，归因于包载Ad-AIPH的热力学(thermodynamic)自由基释放效应。

3.4. Uptake of QC-AA@Tra in BT474 orthotopic breast cancer tumors

研究人员将QC-AA@Tra或游离QC-AA(Q3-CD+Ad-AIPH非偶联物)尾静脉注射BT474荷瘤小鼠，NIR-II实时成像示两组肿瘤荧光均于8 h达峰后渐降；QC-AA@Tra肿瘤/非肿瘤(T/NT)比值较QC-AA高2.3倍，主要脏器荧光定量也证实QC-AA@Tra在肿瘤组织富集显著高于游离QC-AA，表明QC-AA@Tra经曲妥珠单抗介导具优异体内肿瘤靶向及富集能力。

3.5. PTDT of BT474 orthotopic breast cancer tumors by QC-AA@Tra

研究人员设6组(BALB/c nu/nu雌性小鼠，n=4)：PBS、808 nm alone、QC@Tra、QC@Tra+808 nm、QC-AA@Tra、QC-AA@Tra+808 nm。尾静脉注射8 h后808 nm激光(1 W/cm², 5 min)照射，QC-AA@Tra组瘤区升温7.4℃，高于PBS组(2.5℃)。18天监测显示PBS及单纯激光组肿瘤快速生长；QC@Tra、QC@Tra+808 nm及QC-AA@Tra组有一定抑制(曲妥珠单抗抗HER2效应)；QC-AA@Tra+808 nm组肿瘤显著抑制，肿瘤抑制率(TIR)达87.5%，解剖瘤体积及重量最小。各组小鼠体重无明显下降；H&E及TUNEL染色示QC-AA@Tra+808 nm组肿瘤组织严重DNA损伤；主要脏器H&E示PBS及单纯激光组有肺转移，其余组未见，表明QC-AA@Tra在体内具低全身毒性及潜在抑制转移作用。

讨论与结论翻译：综上所述，研究人员开发了一种三位点NIR-II支架(scaffold)，可实现模块化及多载荷功能化。基于此构建了由曲妥珠单抗、NIR-II荧光团Q3及两个负载Ad-AIPH的环糊精分子组成的新型多载荷曲妥珠单抗-药物偶联物QC-AA@Tra，用于HER2阳性乳腺癌治疗。体外及体内研究均表明，QC-AA@Tra对HER2阳性BT474肿瘤细胞具优异靶向能力，并在808 nm激光照射下产生显著光热-动力治疗效应。通过协同整合光热、热力学(thermodynamic, AIPH热解自由基)及化疗(曲妥珠单抗抗HER2)三重作用，在活体小鼠中实现对HER2阳性乳腺癌准确高效的治疗。本工作不仅验证了该三位点NIR-II支架用于构建多功能ADC的实用价值，也为开发具多种治疗模式的ADC提供了通用策略，为HER2阳性恶性肿瘤精准诊断与治疗提供了有效工具。