嵌入式仅细胞生物打印构建结构定向的半月板纤维软骨

《Materials Today Bio》：Embedded cell-only bioprinting to engineer structurally aligned meniscal fibrocartilage

　　

功能性半月板移植物（meniscal grafts）的构建仍难以实现，这主要是由于无法重现天然组织中高度有序的胶原（collagen）架构，而这种架构是其生物力学功能的核心。在本研究中，研究人员探究了外部几何约束（external geometric confinement）能否引导由间充质干细胞/基质细胞（mesenchymal stem/stromal cells, MSCs）生成的纤维软骨组织中的胶原定向。首先，将MSCs浇铸在非粘附性琼脂糖（agarose）通道内，该通道支持了纤维软骨组织的发育，其胶原纤维平行于约束琼脂糖孔的长轴排列。为将这些发现转化为可扩展的生物制造平台，研究人员将仅含MSCs的生物墨水（MSC-only bioinks）生物打印到甲基丙烯酸化黄原胶（methacrylated xanthan gum, XGMA）支撑浴中，以生成不同宽度的丝状结构。研究发现，减小丝状宽度增强了胶原定向和纤维软骨基质的沉积。为阐明细胞力学转导（cellular mechanotransduction）在观察到的边界诱导胶原组织中的作用，研究人员在培养过程中抑制了YAP和ROCK通路。尽管抑制破坏了细胞骨架和细胞核的排列，但胶原组织仍保持高度定向，且布里渊频移（Brillouin frequency shift）未观察到差异。最后，该策略被放大以制造各向异性纤维软骨片和环向排列的半月板样结构。总体而言，本研究的发现确立了外部几何约束作为一种强大且可扩展的策略，用于构建具有更仿生胶原组织的半月板移植物，这可能为未来无支架半月板移植物的开发铺平道路。

论文解读：几何约束引导的半月板纤维软骨生物打印

研究背景与问题：半月板（meniscus）是膝关节中楔形纤维软骨组织，其高度有序的胶原架构（以环向胶原纤维为主）对于抵抗张应力和有效负载分配至关重要。然而，半月板损伤或退变极为普遍，在中年及以上人群中患病率达35%，且显著增加骨关节炎风险。当前治疗如部分或完全半月板切除术仅提供暂时疼痛缓解，并导致组织功能下降和关节生物力学改变。传统组织工程方法难以重现天然半月板的复杂仿生胶原组织，导致构建物力学性能有限。因此，开发具有仿生胶原网络和功能生物力学特性的半月板移植物是未满足的临床需求。三维（3D）生物打印可精确控制植入物大小和解剖匹配，但现有研究多聚焦纤维软骨生成和宏观几何匹配，对构建物内胶原定向评估不足。虽有研究利用熔融电写（MEW）聚己内酯（PCL）支架或透明质酸微纤维添加剂引导胶原，但存在降解慢、异物反应或打印堵塞等局限。嵌入生物打印（embedded bioprinting）能通过支撑浴施加物理边界条件而不改变生物墨水成分。本课题组先前用甲基丙烯酸化黄原胶（XGMA）支撑浴引导关节软骨祖细胞定向，但XGMA在半月板组织工程中的应用及边界诱导胶原定向的机制尚未探索。因此，本研究旨在：（1）探究XGMA边界间距对生物打印间充质干细胞（MSCs）定向的影响；（2）通过抑制YAP和ROCK信号通路阐明细胞力学转导在边界诱导胶原组织中的作用；（3）生物打印具有环向胶原网络架构的纤维软骨组织，以实现更仿生的半月板移植物。

研究概述：研究人员采用外部几何约束策略，首先在非粘附性琼脂糖通道中铸造MSCs，证实胶原沿长轴定向；随后将MSCs单独生物墨水打印到XGMA支撑浴中，调整打印速度生成不同宽度丝状物，发现窄丝增强胶原定向和纤维软骨基质沉积；通过抑制YAP和ROCK通路，揭示胶原定向可独立于细胞力而维持；最后放大策略制造各向异性纤维软骨片和环向半月板样构建物。该研究发表《Materials Today Bio》，证明几何约束是构建仿生半月板移植物的强大可扩展方法。

关键技术方法：MSCs分离自成年雌性山羊胸骨骨髓，经扩增至第4代。主要技术包括：（1）琼脂糖通道铸造：用3D打印模具在4%琼脂糖中铸造500 μm宽立方体通道，注入MSCs-氧化海藻酸钠水凝胶，交联后培养3周；（2）XGMA支撑浴制备：将黄原胶甲基丙烯酸化后冻干，重悬于DMEM并添加光引发剂；（3）3D生物打印：用挤出式生物打印机将第4代MSCs以1 μL/s速率打印入XGMA浴，通过改变打印速度（5-15 mm/s）获得250、580、1000 μm三种丝宽，随后UV交联支撑浴；（4）通路抑制：在250 μm丝培养中加入1 μM Verteporfin（YAP抑制剂）或10 μM Y-27632（ROCK抑制剂）共21天；（5）表征方法：活/死染色、组织学（H&E、阿尔新蓝、天狼星红、茜素红）、免疫组化（I型/II型胶原）、免疫荧光（YAP和F-肌动蛋白）、偏振光显微镜（PLM）评估胶原定向、布里渊显微镜测微力学、生化分析（DNA、sGAG、胶原定量）及单轴拉伸力学测试。

研究结果：

**3.1 外部几何约束可指导铸造和生物打印MSC丝中的新生组织胶原**：在非粘附性琼脂糖通道（宽500 μm）中铸造MSCs-氧化海藻酸钠水凝胶，3周培养后形成富含sGAG和胶原的纤维软骨组织，偏振光显微镜显示胶原沿通道长轴定向。随后在XGMA浴中生物打印不同宽度丝（250、580、1000 μm），7天时细胞活力均>80%。3周后，所有丝中胶原均沿长轴定向，但仅窄丝（250 μm）呈现贯穿组织深度的连续定向，而宽丝仅在边缘定向。生化分析显示窄丝中sGAG/DNA最高，表明紧密约束增强软骨生成基质产生。选择250 μm用于后续实验。

**3.2 抑制YAP和ROCK后新生组织胶原定向仍维持**：在250 μm丝中连续抑制YAP或ROCK通路21天。免疫荧光证实YAP抑制剂组无核YAP定位，ROCK抑制剂组核YAP染色减弱；ROCK抑制剂组肌动蛋白应力纤维丢失和紊乱。对照组细胞和细胞核显著沿丝长轴排列，而抑制剂组排列被破坏。然而，PLM显示所有组新生组织胶原仍优先平行于边界长轴定向，定向相干性无差异；免疫组化显示纤维软骨表型（I型胶原阳性，II型弱阳性）。布里渊显微镜显示各组布里渊频移无差异，表明微力学性质相近。

**3.3 XGMA支撑浴作为外部边界引导生物打印纤维软骨中环向胶原组织**：将250 μm丝相邻打印成矩形片（5 mm×3 mm），培养6周后，组织学确认sGAG和胶原沉积，I型胶原阳性。PLM显示胶原沿片长轴定向。单轴拉伸测试获得斜坡模量311.2 kPa、平衡模量161.1 kPa、动态模量1206.3 kPa。进一步打印半月板形状的环向MSC线，培养3周后组织学显示sGAG和胶原阳性，无钙沉积，I型胶原强于II型。PLM证实胶原沿打印路径形成环向排列，模拟天然半月板环向纤维。

总结讨论：边界诱导的胶原定向在抑制YAP和ROCK后仍保持，表明该过程可能不依赖细胞生成力，但其他力敏感信号通路（如ERK）可能参与。布里渊显微镜结果一致。放大后构建物的力学性能虽达MPa范围，但仍远低于天然半月板，与胶原合成和交联水平有关。未来需可控降解XGMA支撑浴实现无支架移植物；通过空间生化信号实现内/外区表型差异（如II型胶原丰富内区、I型胶原丰富外区）；解决大型多层构建物的营养扩散限制。研究结论：本研究证明外部几何约束是引导工程化纤维软骨中新生组织胶原定向的重要线索。通过铸造和嵌入生物打印的MSC构建物，研究人员发现物理边界本身可诱导沿约束轴的强烈优先胶原组织。抑制YAP和ROCK虽破坏细胞和核排列但未损害胶原组织，表明边界诱导的胶原定向可能独立于细胞生成力，但其他力敏感信号通路可能有贡献。基于边界诱导定向原理，研究人员成功制造了结构各向异性纤维软骨片和环向排列的半月板样构建物。这些发现表明嵌入生物打印不仅实现高分辨率生物制造，还可战略性引入几何线索，为构建具有更仿生胶原架构的半月板移植物提供强大平台。