《Materials Today Bio》：Engineered Microtissue Systems for Identifying the Roles of Wnt and YAP Signaling in Hepatoblast Differentiation and Organization
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肝脏发育需要生化和物理精确协调以建立适当的功能分区（zonation）和局部细胞命运决定。然而，目前缺乏在确定微环境背景下研究信号通路之间相互作用模型。本研究中，研究人员采用互补的二维（2D）微阵列和三维（3D）微孔平台系统研究了Wnt和YAP（Yes-ass
肝脏发育需要生化和物理精确协调以建立适当的功能分区（zonation）和局部细胞命运决定。然而，目前缺乏在确定微环境背景下研究信号通路之间相互作用模型。本研究中，研究人员采用互补的二维（2D）微阵列和三维（3D）微孔平台系统研究了Wnt和YAP（Yes-associated protein，Yes相关蛋白）信号通路如何调控肝母细胞分化并影响空间模式。siRNA介导的APC（Adenomatous Polyposis Coli，腺瘤性息肉病蛋白）敲除增强了胆管标志物表达，并激活了Notch信号靶点Hey1和Hes1，同时破坏了空间组织模式。YAP抑制主要影响2D中的肝细胞分化，但在3D微组织中显著抑制胆管分化，揭示了平台依赖性效应。阵列培养分析显示，YAP敲除导致的细胞质YAP水平降低与黏附连接（adherens junction）蛋白表达的伴随变化相关。总体而言，2D和3D微组织平台之间的差异反应表明了细胞间相互作用信号的上下文依赖性，其中几何依赖性效应影响分化细胞类型的空间分布。组合通路调节表明，Wnt和Notch信号协同调控胆管命运，而YAP通过几何特异性机制发挥关键决定作用。这些发现突显了工程化培养模型在研究协调肝脏祖细胞命运决定过程中生化和物理信号通路方面的应用价值。
## 一、研究背景与问题提出
肝脏是人体代谢的核心器官，执行着代谢平衡、胆汁分泌和营养储存等多种关键功能。为实现这些功能，肝脏被组织成具有精确定向的功能区带（zonation），包括中央静脉周围（pericentral）、小叶中间区（midlobular）和门脉周围（periportal）三个肝区，各区肝细胞在不同信号梯度作用下执行特定功能。肝细胞与胆管细胞均起源于双潜能肝脏祖细胞——肝母细胞，其在胚胎发育过程中的分化与组织对于确保肝脏正常功能至关重要。肝脏区带形成和胆管形成受到周围组织微环境所提供的生化和物理信号的精密调控。
Wnt/β-Catenin信号通路是肝脏区带形成和肝细胞分化的重要贡献者，尤其在β-catenin高表达的中央静脉周围区域发挥关键作用。APC和GSK3β作为该通路的关键负调控因子，通过促进β-catenin降解来抑制Wnt信号。尽管APC和GSK3β均 functioning于经典Wnt通路，但APC还在细胞极性、迁移和染色体分离等方面具有独立作用，可能影响肝脏细胞命运。此外，Notch、Hippo和TGF-β等信号通路也参与胆管分化与胆管形成，凸显了肝脏组织复杂性。然而，部分通路的确切作用尚不明确；例如，Hippo信号通路通过其效应分子YAP在不同动物模型中展现出对肝脏区带的上下文依赖性效应。YAP对于胆管分化和导管形态发生也是必需的。尽管生化调控研究取得显著进展，但机械力如何影响这些模式的认识仍然有限。发育或疾病进展过程中微环境的破坏常改变机械信号，导致组织失调和功能受损。
传统体内外平台难以研究信号通路之间的复杂交互作用，因此需要能够精确调控生化和物理信号的工程化系统来模拟时空复杂性并解析信号相互作用。基于此，研究人员采用模块化的2D微阵列和3D微孔系统，通过结合siRNA介导的基因沉默和小分子抑制剂与工程化微环境，系统研究了Wnt和YAP信号通路失调如何影响肝脏祖细胞命运和组织，以揭示微环境信号与这些通路协同调控细胞命运和组织的机制。
## 二、关键技术方法概述
本研究主要采用以下关键技术：2D聚丙烯酰胺微阵列制备技术，通过在特定刚度（1 kPa、6 kPa、25 kPa）凝胶上沉积细胞外基质（ECM）蛋白形成高密度细胞培养岛状结构；3D聚乙二醇（PEG）丙烯酸酯微孔制造技术，制备球形（spheroid）和环形（toroid）两种几何构型的无支架多细胞聚集体；小分子干扰RNA（siRNA）转染技术，用于APC、YAP、CDH1等基因的靶向沉默；免疫荧光染色与成像分析技术，包括Widefield荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜及ImageJ、CellProfiler、IMARIS等图像分析软件，用于定量化细胞标志物表达和空间分布；实时定量PCR（RT-qPCR）技术用于基因表达定量；牵引力显微镜（TEM）技术用于测量细胞产生的机械力；主成分分析（PCA）用于多基因表达数据的降维和模式识别。
## 三、研究结果
### 3.1 Wnt和YAP信号失调调节肝细胞分化
研究人员利用高通量2D细胞微阵列培养系统，在模拟健康肝脏组织刚度（1 kPa）的聚丙烯酰胺凝胶上沉积胶原I形成培养岛，种植双潜能小鼠胚胎肝脏（BMEL）细胞，通过siRNA介导的基因敲除和小分子抑制剂干扰Wnt和YAP信号，分化72小时后进行分析。免疫染色显示，siAPC处理增加了骨桥蛋白（OPN）表达，使细胞向胆管命运偏移，同时破坏了空间组织模式，将岛中心的OPN阳性细胞从2%增加至26%，外周区域从29%增至56%。siYAP处理则使肝细胞核因子4-α（HNF4α）阳性细胞减少22.8个百分点，但对OPN表达无显著影响。小分子抑制剂实验进一步验证：CHIR99021（GSK3β抑制剂）增加OPN阳性细胞3.25倍并改变空间模式，而verteporfin（YAP/TEAD复合物抑制剂）降低HNF4α表达。额外标志物验证显示，siAPC增加SOX9表达（尤其在岛中心），适度降低白蛋白染色；siYAP虽减少HNF4α，但白蛋白在岛中心略有增加。RT-qPCR证实siAPC上调OPN表达，siYAP下调Cebpa（肝细胞分化相关转录因子）。
### 3.2 基质刚度和细胞外基质成分与生化信号协同调控肝脏祖细胞命运
研究人员利用微阵列系统研究了基质刚度与ECM成分对APC和YAP敲除细胞的协同效应。ECM成分包括100%胶原I（C1）、50%胶原I、胶原I+Glypican 3（C1/G3）、胶原I+Decorin（C1/DC）和胶原I+Lumican（C1/LU）。结果显示，C1/G3在所有条件下降低OPN阳性细胞（16%降至12%）和SOX9阳性细胞；C1/LU则增加SOX9阳性细胞1.32倍。基质刚度对OPP无显著影响，但25 kPa凝胶使SOX9阳性细胞降低1.57倍。特定组合产生独特效应：亲刚度增加时ECM效应减弱。HNF4α和白蛋白分析显示，刚度对HNF4α影响最小，但6 kPa凝胶上白蛋白阳性细胞较1 kPa和25 kPa分别增加1.39倍和1.65倍。
### 3.3 Wnt激活增加Notch转录因子表达而YAP抑制不影响典型Hippo信号靶基因
研究人员进一步探究了Wnt扰动改变空间命运的机制。尽管Wnt扰动改变细胞模式， fled力显微镜显示岛中心的力并未增加，无法解释这种变化。基因表达筛查发现，siAPC导致Wnt下游基因AXIN2增加138倍，Notch转录因子Hey1和Hes1分别增加3.1倍和1.6倍；CHIR99021处理呈现类似趋势（AXIN2增加185倍，Hey1增加4.2倍，Hes1增加2.1倍）。然而，siYAP处理尽管大幅降低HNF4α蛋白表达，却不影响Hippo靶基因AXL和CTGF；verteporfin仅使AXL和CTGF分别降低32%和42%。主成分分析显示siAPC细胞在PC1和PC2上与对照分离，AXIN2与Hey1、Hes1表达强相关，表明Wnt和Notch信号在胆管命运调控中存在协同关系。
### 3.4 Wnt和Notch信号介质共同参与胆管命运诱导
研究人员采用siRNA沉默联合药物处理的组合策略，评估多通路失调时的信号交互。DAPT（Notch抑制剂）降低所有条件的OPN表达；siAPC联合DAPT处理使OPN表达的空间模式恢复至接近对照，表明Notch激活是siAPC影响细胞空间命运的必要条件。相反，siAPC联合CHIR99021使全岛OPN阳性细胞比例较单独处理增加15%。YAP敲除在2D中对胆管分化无协同作用。对于肝细胞命运，siYAP在所有条件下抑制肝分化24-29个百分点；DAPT可增加HNF4α表达，尤其在siYAP条件下最显著，提示抑制Notch有助于导向肝细胞命运。Wnt信号修饰对HNF4α有矛盾效应：GSK3β抑制不降低HNF4α，而siAPC却降低，提示APC可能通过Wnt非依赖性机制影响肝命运。
### 3.5 YAP抑制而非YAP/TEAD复合物抑制增加黏附连接蛋白
研究人员量化分析了黏附连接蛋白E-Cadherin和β-Catenin的表达。结果显示，siAPC对两种蛋白影响可忽略不计，而siYAP显著增加两者表达（尤其在岛中心）。这一发现与siYAP报告较低细胞密度和较少肝细胞分化的结果相悖，因先前研究已显示HNF4α表达依赖E-Cadherin。YAP/TEAD复合物抑制（verteporfin）未显示相同效应。YAP在E-Cadherin介导的接触抑制中发挥关键作用，磷酸化状态下可与黏附连接相互作用。免疫染色显示siYAP降低细胞质YAP水平但不降低核YAP，导致核质比显著升高，提示细胞质YAP在肝细胞分化中具有重要作用。
### 3.6 微组织几何形状与Wnt/YAP通路扰动影响3D分化程度和组织空间模式
研究人员采用无支架3D多细胞聚集体（微组织）研究定义多细胞几何中信号通路调制效应。4臂PEG丙烯酸酯微孔用于制造球形和环形两种几何构型。siYAP处理使各条件下细胞密度降低至对照的53%。与微阵列类似，siAPC在两种几何中均增加OPN阳性细胞、减少HNF4α阳性细胞；但siYAP在3D中几乎完全抑制OPN表达，与2D中无变化形成鲜明对比。几何形状本身也影响细胞命运：环形中siYAP和siAPC的HNF4α和OPN阳性细胞均较球形减少，而siNTP条件环形中HNF4α阳性细胞增加。
空间分析显示，siNTP对照中HNF4α阳性细胞分布于整个微组织，但外层（距离表面更近）浓度更高，与有限元模型显示的该区域受张力一致。OPN阳性细胞呈现类似模式，但环形几何在中心附近OPN表达急剧下降。siAPC在球形中保持siNTP模式，但在环形中OPN阳性细胞峰值转移至中间区域，该区域据3D有限元模型显示受压最大。siYAP处理的环形中HNF4α无空间组织，而球形保持表面高表达趋势。这些结果证明了多细胞聚集几何形状在协调细胞间信号调控分化模式中的协同作用。
## 四、讨论与结论
本研究利用高通量2D和3D微组织系统系统评估了Wnt、YAP和Notch信号通路在肝脏祖细胞分化中的相互作用。研究发现，Wnt破坏复合物组分抑制破坏了典型空间组织，同时通过Notch信号协同互动增强胆管分化。YAP信号调制对肝细胞和胆管标志物表达的影响依赖于培养环境。这些结果证明了整合多信号通路与机械信号以理解肝脏细胞命运决定和组织的必要性。
APC或GSK3β抑制后增强的OPN表达表明Wnt信号激活促进胆管分化，伴随的AXIN2表达增加显示Wnt信号的负反馈调控。Wnt和Notch信号在胆管分化中的协同关系尤为显著，APC或GSK3β抑制显著增强Notch下游靶点Hey1和Hes1表达，表明Wnt激活增强Notch信号活性，这与肠道发育中的观察一致。Notch抑制能够逆转APC抑制效应，进一步支持这一协同模型。APC与GSK3β抑制对HNF4α的差异效应揭示了肝细胞分化的通路特异性调控：APC抑制大幅降低HNF4α，而GSK3β抑制影响甚微，提示APC通过Wnt破坏复合物非依赖性机制发挥功能。
受控多细胞几何在2D和3D系统中产生不同的空间模式效应，这些效应可被生化信号进一步调节。Wnt通路调制改变了这些模式，尤其在3D微组织中，siAPC处理将环形中OPN表达峰值从表面转移至中间受压最大区域，表明几何施加的压缩梯度与Wnt信号扰动协同影响胆管分化。YAP作为肝细胞分化的关键调控因子，其抑制在2D系统中产生最显著的肝分化效应，但不影响典型Hippo靶基因，提示YAP可能通过非经典机制发挥作用。siYAP处理后细胞质YAP减少和黏附连接蛋白增加，指向YAP在细胞-细胞接触处机械感应中的作用。3D中siYAP对胆管分化的不同效应（2D中无变化，3D中显著抑制）突显了YAP功能对几何依赖性细胞-细胞相互作用上下文的高度敏感性。
工程化微组织模型的互补应用对于解析信号通路与生物物理信号之间的复杂相互作用至关重要。2D微阵列平台实现了细胞-ECM相互作用和基质性质的精确控制，而具有确定几何的3D微组织提供了生理相关的细胞-细胞相互作用和不同机械上下文。Wnt和Notch信号在指导胆管分化中的协同互作鉴定，为工程化肝脏组织中胆管细胞命运的操控提供了新靶点。YAP的几何依赖性功能，特别是2D与3D培养环境之间的差异效应及其与细胞质YAP水平和黏附连接表达的关联，进一步突显了YAP在肝细胞分化中的上下文特异性作用。
总之，本研究建立的基础有助于未来利用模块化微组织平台系统引入和评估非实质细胞、氧梯度、营养可用性和复杂ECM组成等额外因素，全面研究肝脏祖细胞如何整合多种信号输入与几何和物理信号，为理解肝脏发育、再生和疾病中的细胞命运决定和组织形成提供机制性见解。这些核心发育通路如何与确定几何上下文相互作用的认识，也可能为纤维化、胆管病变等以组织结构改变和细胞命运异常为特征的肝脏疾病治疗策略提供信息。
