《Materials Today Bio》：Identification of a cell subpopulation with different response to lipid nanoparticles and effect of protein corona on uptake and transfection
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脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles, LNPs）已实现首款RNA类药物的获批，但其细胞行为诸多方面仍不清楚。本研究采用组成与Onpattro相似的LNPs，通过流式细胞术分析其在数千个单个HeLa细胞中的摄取、转染效率及效应，以确定细胞群内单
脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles, LNPs）已实现首款RNA类药物的获批，但其细胞行为诸多方面仍不清楚。本研究采用组成与Onpattro相似的LNPs，通过流式细胞术分析其在数千个单个HeLa细胞中的摄取、转染效率及效应，以确定细胞群内单个细胞结果的变异性。研究人员发现，与LNPs孵育后可出现一个细胞亚群，其摄取相当但转染效率显著降低，并伴有细胞应激和毒性迹象；该亚群在空载LNPs及载RNA LNPs中均可观察到，且使用不同LNP制剂及其他细胞类型得到可比结果。此外，升高LNP浓度时摄取、内体渗漏及转染先升后降，较高摄取水平伴随细胞活力丧失；不同LNP浓度下分散液的表征显示，含血清培养基中LNPs吸附的蛋白量随LNP浓度升高而降低。同样，提高血清浓度接近生理条件时摄取和转染也发生显著变化。综上结果表明，对LNPs的响应具高度异质性，细胞群中部分细胞对LNPs更敏感；此外LNPs在生物环境中经修饰后强烈影响其摄取和转染。
一、研究背景与目的意义
脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles, LNPs）因搭载siRNA的首款药物Onpattro（Patisiran）获批及mRNA疫苗（BioNTech/Pfizer、Moderna）的广泛应用，成为重要的核酸非病毒递送载体。然而目前仍存在诸多局限：LNP稳定性、免疫原性、胞内递送效率低、肝外递送困难，且不同细胞间mRNA-LNP转染和蛋白表达效率差异大，许多细胞类型难以被转染。已知LNP理化性质（脂质组成、粒径、ζ电位、表观pKa）至关重要，而细胞内因素——尤其是内体逃逸（endosomal escape）效率低导致多数LNP滞留于内溶酶体被降解——仍是临床转化障碍。此外，细胞群内个体细胞间存在细胞—细胞异质性（cell-to-cell heterogeneity），受细胞周期、大小、基因表达差异影响纳米颗粒摄取，但单个细胞内转染变异性的来源及摄取与转染相关性知之甚少。另一关键因素是LNP进入生物介质后形成蛋白冠（protein corona），PEG化脂质可转移至血清组分，冠组成驱动体内分布（如Onpattro吸附载脂蛋白E靶向肝细胞LDL受体），且已有报道LNP摄取和转染随LNP含量呈钟形趋势，存在"最佳LNP–血清比"，但蛋白/脂质比如何影响冠组成继而改变摄取和转染尚未阐明。因此，需从单细胞水平解析LNP–细胞互作异质性及生物环境下蛋白冠的调控作用，以优化LNP设计。本文由Fayyaz HA等发表于《Materials Today Bio》，采用类Onpattro组成LNPs及流式细胞术单细胞分析，旨在：（1）量化HeLa细胞群内LNP摄取、转染及细胞响应的细胞间变异性，鉴定具不同LNP响应的细胞亚群；（2）探究LNP浓度及血清含量改变所致生物环境修饰（蛋白冠）对LNP摄取和转染的影响。
二、主要关键技术方法
研究人员使用微流控混合法制备类Onpattro组成的LNPs（离子化可电离阳离子脂质D-Lin-MC3-DMA:辅助脂质DSPC:PEG化脂质DMG-PEG2000:胆固醇:荧光标记脂质DiI＝50:9.9:38.5:1.5:0.1摩尔比），包载poly-A或eGFP mRNA（脂质:RNA＝40:1 w/w），通过透析纯化；部分实验用涡旋混合法制备或改用SM-102离子化脂质制剂。LNPs经动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）、纳米颗粒示踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）、ζ电位及冷冻电镜（Cryogenic Transmission Electron Microscopy, Cryo-TEM）表征。人宫颈癌HeLa细胞（部分实验用HuH-7、HCT-115、A549细胞）常规培养后，与不同浓度LNPs孵育不同时间，流式细胞术检测DiI荧光（PE通道，代表LNP摄取uptake）和eGFP荧光（FITC通道，代表转染效率transfection efficiency），前向散射（Forward Scatter, FSC）与侧向散射（Side Scatter, SSC）鉴别细胞亚群；用钙黄绿素（calcein）内体渗漏实验评估内体逃逸/渗漏（endosomal leakiness），MTT法、可固定死活染色染料eFluor? 450及碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）/Annexin V双染色评估细胞活力（viability）与凋亡。通过尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC）分离不同LNP浓度下含血清培养基中形成的蛋白冠包被LNPs，BCA/DC蛋白试剂盒定量冠蛋白量，十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）银染分析冠蛋白组成。
三、研究结果
LNP preparation and characterization（LNP制备与表征）
微流控混合（总流速Total Flow Rate, TFR＝1.2 mL/min，体积流速比Flow Rate Ratio, FRR＝3:1水相/有机相）制得poly-A及eGFP mRNA负载LNPs，包封率＞90％；DLS平均水合粒径约120 nm（聚-A）和105 nm（mRNA），NTA约95 nm，多分散指数Polydispersity Index, PDI＜0.2，ζ电位近中性；Cryo-TEM显示典型多层/囊泡状形态；在含10％胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）完全培养基（complete cell culture Medium, cMEM）中稳定，主峰～128 nm，另有10–30 nm游离血清蛋白峰。提高TFR可减小粒径。
LNP uptake, transfection and endosomal leakiness in HeLa cells（HeLa细胞中LNP摄取、转染及内体渗漏）
4 h孵育poly-A LNPs（3–200 μg/mL总脂质），摄取随LNP浓度呈非单调钟形曲线（先升后降），DLS证实各浓度分散稳定排除聚集因素。流式FSC/SSC点图中，未处理细胞为主群（subset 1，红），LNP孵育后出现第二亚群（subset 2，蓝），FSC减小、SSC相近，随LNP剂量增至约占40％；subset 2摄取略低于subset 1但仍呈钟形趋势。空载LNPs及不同制剂（SM-102 LNPs）、其他细胞系中也检测到subset 2，比例和出现剂量依细胞类型而异。用eGFP mRNA LNPs发现两亚群摄取相当（subset 2稍低），但subset 2几乎无eGFP信号（4 h），24 h才微弱检出且远低于subset 1，表明subset 2转染严重受损。摄取（DiI）与转染（eGFP）在单个细胞水平正相关，但转染分布离散度远大于摄取，subset 1中转染异质性更强。Calcein内体渗漏实验显示4 h时渗漏细胞数随LNP浓度先增后减，与转染趋势一致。表明群体中存在对LNP更敏感的细胞亚群，摄取相近但内体逃逸或翻译 machinery受损致转染极低。
Kinetics of LNP uptake and transfection（LNP摄取与转染动力学）
12.5 μg/mL总脂质孵育，摄取随时间线性增加后表观饱和；subset 2在2 h即可辨，6 h占比达20–40％，30 h回落至5–20％。转染动力学与摄取匹配（至6 h），subset 2仅24 h后有微弱eGFP。再次确认转染细胞间变异性大于摄取。
Effect of LNPs on cell viability（LNP对细胞活力的影响）
4 h MTT法未见明显毒性；24 h中间LNP浓度（25–50 μg/mL总脂质，较高摄取区）活力降至50–70％，光镜见细胞密度下降及死亡细胞，流式总细胞计数减少。eFluor 450死活染色显示subset 2部分阳性（～20％），PI/Annexin V双染subset 2全部阳性（～35–40％），subset 1基本阴性。subset 2细胞周期分布与对照无差异。表明subset 2为膜完整性受损的濒死/死亡细胞，属LNP高敏感亚群，高摄取伴细胞毒性可致部分细胞丢失。
Effect of protein corona and serum content on LNP uptake and transfection（蛋白冠及血清含量对LNP摄取和转染的影响）
模拟剂量实验中LNP:蛋白比例（25–200 μg/mL LNPs于10％ FBS cMEM），SEC分离冠包被LNPs，定量显示单位脂质吸附蛋白量随LNP浓度升高递减；SDS-PAGE显示高浓度LNP冠总蛋白量减少但谱带模式相似。说明钟形摄取曲线的高浓度段下降关联冠蛋白（促摄取蛋白）耗竭/置换。改变FBS浓度（0–100％ FBS）：≤10％ FBS呈典型钟形剂量响应；≥10％ FBS趋近生理浓度时，摄取随LNP剂量近似线性上升，转染平行变化；低LNP浓度时高血清抑制摄取（游离蛋白竞争），高LNP浓度（＞40 μg/mL）时高血清反促摄取。LNP预孵育血清（10％或全血清）4–24 h未增加摄取，排除单纯PEG脱落/冠成熟主导。证实生物环境中LNP–蛋白比决定冠特征，强烈调控后续细胞互作。
四、讨论与结论翻译
研究人员总结：本研究用流式细胞术单细胞分析发现，类Onpattro LNPs与HeLa细胞孵育后出现具不同前向散射特性的第二细胞亚群——摄取略低但转染严重降低，且该亚群表现细胞应激及膜完整性丧失，属对LNP更敏感的亚群，其响应差异需进一步阐明（可能涉及内体逃逸能力），识别相关因子可助避免LNP诱导的细胞损伤并减小效能异质性。此外，改变LNP浓度或血清含量影响脂–蛋白比从而改变蛋白冠形成：高LNP浓度时冠吸附蛋白量减少，促摄取冠蛋白可能被耗竭/置换，致摄取、内体渗漏及转染下降（钟形趋势）；提升血清至近生理浓度可改变剂量响应模式甚至消除钟形曲线。表征冠组成以鉴定促摄取蛋白有助开发提升生理条件下LNP摄取和转染的新策略。
Conclusion（结论原文翻译）：
本工作研究了包载大分子RNA的中性LNPs在HeLa细胞中的摄取行为与转染。借助流式细胞术测量数千个单个细胞的荧光和光散射特性，研究人员检测到主细胞群外出现具不同前向散射的第二细胞亚群。该亚群在低浓度、短暴露时间即出现，摄取略减但转染大幅降低；光散射改变及膜完整性丧失与活力下降表明其为对LNPs更敏感、翻译机制严重受损的细胞。导致不同响应的原因需进一步阐明，内体逃逸差异可能部分贡献。识别引致不同细胞响应的因素可帮助设计避免此类效应、降低结果异质性与提升整体效能的LNPs。此外，通过改变LNP及血清浓度，研究人员探究了生物介质中分散时LNP所受修饰对其摄取和转染的影响。与近期文献一致，摄取、转染及内体渗漏呈钟形趋势，中等LNP浓度（摄取及上述指标最高处）伴随细胞活力下降，两鉴定出的细胞亚群均呈此趋势。改变脂质–蛋白比影响蛋白冠形成；为验证此关联，研究人员隔离了细胞实验所用剂量范围内不同LNP浓度下形成的冠包被LNPs，确定高LNP浓度时LNP吸附冠蛋白量减少，对应摄取与转染降低——提示LNP含量升高时促摄取冠蛋白耗竭和/或被其他降低摄取效率组分置换，引致摄取、内体渗漏及转染下降。先前研究显示0–10％ FBS变动亦改变摄取转染，暗示存在促进LNP效能的最佳蛋白–脂质比。为进一步验证，研究人员在近生理浓度全血清条件下测定摄取转染，某些条件下摄取与转染随血清升高反而增加，再次强调LNP进入生物体液后所受修饰对其摄取及细胞行为的强烈影响。详细表征此条件下LNP吸附冠组成以鉴定促摄取冠蛋白，可助开发提升生理条件LNP摄取与转染的新策略。
