《Ecology》：High phylogenetic turnover magnifies evolutionary relatedness along bacterial primary succession
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当前微生物原生演替模型假设随机性主导土壤群落组装的早期阶段，产生系统发育随机模式，并随着非生物和生物过滤因子的增强而逐渐消失。研究人员假设，在严重环境胁迫下，非生物过滤因子可能从早期演替阶段起就超越随机性，导致系统发育聚类，这是由于耐胁迫谱系的过度代表性。聚类
当前微生物原生演替模型假设随机性主导土壤群落组装的早期阶段，产生系统发育随机模式，并随着非生物和生物过滤因子的增强而逐渐消失。研究人员假设，在严重环境胁迫下，非生物过滤因子可能从早期演替阶段起就超越随机性，导致系统发育聚类，这是由于耐胁迫谱系的过度代表性。聚类可能随着碳更丰富的阶段而放大，这是基于竞争性类群过度代表性所导致的加剧的生物相互作用。研究人员还假设，不同植物生活型及其对土壤条件的对比效应，可能调节微生物演替过程中的系统发育模式。为验证这些假设，研究人员在西班牙东南部地中海干旱区7个样点沿13个物种（分属乔木、灌木、多年生草本和矮灌木4种生活型）的植株大小梯度采集了106份土壤样品。每个梯度中的样品分别在开阔地（先前期况）、幼苗下、幼树和成体植株下采集。在所有情况下，研究人员均检测到演替过程中存在高水平的系统发育聚类，表明随机性的作用可忽略不计。植物和土壤变量驱动了演替过程中的不同过程：浅分歧谱系的聚类随着植物生长和土壤有机质富集而增强，而深分歧谱系的聚类则因植物生活型对土壤水分的影响而变化。在原生演替过程中，系统发育周转率因大型谱系的逐渐富集而增加，这些谱系由亲缘关系密切的有机体组成，且与初始群落系统发育距离较远。研究人员的数据有助于细化当前的细菌原生演替模型，表明：(1)环境过滤因子可以超越原生演替早期阶段的随机性；(2)高水平的系统发育周转率可以伴随微生物群落组装梯度上进化相关性的增加。系统发育模式的转变可能关键性地影响由土壤微生物群驱动的关键生态系统功能，如分解和生物地球化学循环。
细菌群落组装受随机过程（如扩散、生态漂变）和基于生态位的过程共同调控。基于生态位的过程依据物种的环境耐受性（如盐度、干旱或酸度）和生态相互作用（如竞争、交叉互饲）来过滤群落，这些在很大程度上是物种生态需求和功能性状的结果。系统发育信息有助于深入探究群落组装过程，因为进化距离往往反映整个生命之树上的生态相似性，尤其在原核生物中表现明显。因此，评估细菌群落的系统发育结构有助于区分调控微生物群落组装的过程，并最终更好地预测其对生态系统功能的影响。
原生演替中的生态系统是研究驱动群落组装的生态力相对重要性的理想场景。理论上，随机性驱动原生演替早期阶段的微生物群落组装，产生随机的系统发育模式，并随着群落趋于成熟而逐渐失去相关性。然而，当前模型忽视了在非生物胁迫下，环境介导的群落组装可能超越随机性，无论演替阶段如何。在土壤中，pH在决定随机性与基于生态位过程的相对重要性方面起主导作用，偏离中性pH会导致由进化相关成员组成的系统发育聚类群落，这可能基于它们共同抵御酸性或碱性胁迫的能力。研究人员认为，影响土壤微生物群的其他非生物条件（如水分、盐度）可能产生类似的系统发育模式，因为赋予微生物抵御此类非生物胁迫的性状往往具有进化保守性。
聚焦植物群落的研究表明，由于强烈的紫外线辐射、干旱胁迫和贫营养条件，非生物过滤在生态演替早期阶段影响更大，而生物相互作用则随植物发展而增强。在干旱区，植物生态相互作用（包括促进性和竞争性相互作用）已被证明在成熟植物个体发育阶段更加强烈。这些观察可能也适用于土壤微生物群落，因为植物生长同时降低了土壤非生物胁迫并增加了供应给土壤的有机化合物数量。有机质数量沿原生演替的增加与土壤细菌的系统发育周转相关。研究人员假设，这可能是由于资源可利用性促进了具有较高相对适应度的少数细菌类群，这些类群可能竞争性地排除远缘谱系，最终放大系统发育聚类。
研究人员检查了极端非生物胁迫条件下土壤细菌群落的系统发育结构，即在金属矿山尾矿中——这是一种新的人工创造环境，特征为酸性至中性pH、低土壤养分含量、高盐度和高金属（类）浓度，加上极强的辐射和干旱。能够定殖贫瘠区域的耐金属护植物种触发原生演替，形成散布于开阔空间周围的植被斑块。在此背景下，植物生活型已被证明决定着植物斑块改变土壤性质的强度，基于功能不同的植物物种对土壤有机物输入和减少金属（类）等非生物胁迫因子的差异。不同生活型植物下对比鲜明的植物-土壤反馈最终决定土壤微生物活性和分类学多样性的不同水平。
基于此，研究人员假设在极端非生物胁迫下，环境过滤可能降低随机性的贡献，并在整个演替梯度上导致细菌群落的强烈系统发育聚类。这种系统发育聚类可能在碳更丰富的阶段因加剧的生物相互作用而放大。研究人员还预期这种系统发育模式的幅度可能因植物生活型对土壤条件的对比效应而调节。理论上，冠层更密集的植物生活型（即乔木、灌木）通过缓解某些非生物胁迫（如干旱、强辐射）的影响，可能减少系统发育聚类。然而，这种效应可能被沿演替增加的有机化合物量所增强的生物过滤所抵消。
为验证这些假设，研究人员量化了13种植物（分属4种生活型：乔木、灌木、矮灌木和多年生草本）下土壤细菌群落演替梯度上的系统发育群落结构。在研究样点的102种植物中，这13个物种显示出定殖贫瘠区域并在其冠层下促进其他物种从而触发演替的潜力。研究人员检验了细菌系统发育多样性沿演替梯度如何响应：(1)植物生活型和植株大小（即个体发育阶段），以及(2)土壤肥力（有机物质、矿质养分和水分）和土壤非生物胁迫（酸度、盐度和重金属含量)。最后，研究人员分析了主要细菌类群对整体系统发育多样性的贡献。
研究区域位于西班牙东南部穆尔西亚的Cartagena-La Unión矿区（半干旱地中海气候）。2015年，研究人员在约21公顷范围内分散的7个矿点进行了采样。共沿13个植物物种的大小梯度采集了106份表土样品（0-5厘米），包括乔木（Pinus halepensis、Tamarix canariensis和Osyris lanceolata）、灌木（Atriplex halimus、Salsola oppositifolia和Dorycnium pentaphyllum）、矮灌木（Helichrysum stoechas、Paronychia suffruticosa和Limonium carthaginense）和多年生草本（Lygeum spartum、Macrochloa tenacissima、Piptatherum miliaceum和Hyparrhenia sinaica）。每个植物物种在单一矿点内采样以最小化站点效应。每个梯度包括开阔地土壤样品（表征先前期况），以及幼苗（1-2年生，高度<10厘米）、幼树（>10厘米高且无繁殖迹象）和成体（生殖期）下的土壤。植株大小以平均冠幅直径测量，并作为植物年龄的替代指标。样品数量根据每个物种记录的最大植株直径而变化，以平衡生命周期可能相差达二十年的植物梯度间的采样努力。土壤样品由五个子样品组成，取自每个植物斑块的东西南北四个方位和中心位置，随后混合成约1千克样品。所有材料在采样和样品处理过程中用70%乙醇冲洗以避免交叉污染。
基因组DNA从约10克均质土壤中提取，使用PowerMax Soil DNA Isolation Kit。扩增子测序方案针对16S rRNA基因的V3和V4区域，使用通用原核引物Pro341F/Pro805R。按照Illumina方案，使用有限循环PCR生成DNA扩增子文库。随后在Fisabio测序服务平台上使用Illumina MiSeq测序系统进行2×300 bp的双端测序。
在106份采集的矿山尾矿土壤样品中，7份来自开阔地、6份来自植物冠层下的样品因DNA浓度过低而无法进行16S rRNA基因高通量测序，反映了贫瘠基质的低微生物负荷和研究区域用于原生演替研究的适宜性。共获得5,219,471条双端原始reads。原始序列使用prinseq-lite程序进行质量过滤。使用fastq-join程序连接双端reads。使用UCLUST在97%序列相似度下聚类操作分类单元（OTUs），OTU分类学使用GreenGenes数据库确定。共鉴定出30,146个OTUs，仅考虑15条及以上reads的OTUs用于下游分析。
在系统发育推断之前，代表OTUs的12,367条序列使用QIIME中的PyNAST进行比对。应用Lane mask去除高变区域以提高系统发育分析质量。从444个核苷酸位置的比对中，使用RAxML v 7.3.0构建细菌系统发育，采用GTR-GAMMA位点速率替代模型。为避免短序列导致的高系统发育不确定性，树根据Silva数据库构建的巨型树在门水平（变形菌纲在纲水平）约束，并使用Archaeoglobus profundus rooting。
计算平均成对距离（Mean Pairwise Distance, MPD）和平均最近分类单元距离（Mean Nearest Taxon Distance, MNTD）以探索不同系统发育深度上的系统发育多样性。MPD测量从样本中随机抽取的个体对之间的平均系统发育距离，而MNTD计算每个群落中每个物种与其最近亲属的平均距离，因此受系统发育树基部结构的影响较小。由于这些指标受分类学多样性影响，研究人员计算了其标准化效应值（ses.MPD和ses.MNTD）。此外，研究人员估计了群落间的系统发育周转率，以理解原生演替中的主要转变。计算了短系统发育距离上的系统发育周转率（βMNTD）和整个系统发育上的系统发育周转率（βMPD）。正值表示高系统发育周转率，即群落间替换的系统发育距离比随机期望更远。
研究人员首先检验了土壤细菌系统发育多样性是否显著偏离随机期望。具体使用贝叶斯广义线性混合模型（GLMM）检验ses.MPD或ses.MNTD是否偏离零。模型中将"矿点"作为随机因子以解释站点效应。共运行三个贝叶斯GLMM，每个使用来自不同树的系统发育指标计算。然后，研究人员检验了植物生活型或植株大小是否影响细菌系统发育聚类（以ses.MPD或ses.MNTD测量）。此外，还检验了细菌系统发育聚类是否与土壤肥力增加和/或非生物胁迫降低相关。对土壤肥力参数和非生物胁迫参数分别进行主成分分析（PCA）。最后，研究人员识别了导致系统发育聚类变化的细菌类群。
总体而言，相对于零期望，土壤细菌群落呈系统发育聚类，95%可信区间低于零。系统发育聚类的强度沿原生演替变化很大。然而，标准化MPD和MNTD互不相关，并对不同植物和土壤特征作出响应。
聚类模式与系统发育周转率的普遍增加同时发生，即与初始群落系统发育距离更远的群的替换。这种周转率的增加在系统发育尖端（ses.βMNTD）明显，但在考虑整个系统发育时（ses.βMPD）不明显。周转率的增加幅度因植物物种身份而异，但在13个案例中的10个明显。
植物生活型显著影响ses.MPD：乔木和多年生草本下的土壤细菌群落比灌木下更为系统发育聚类。矮灌木下的ses.MPD与其他生活型无显著差异，由于种间变异较大。相反，ses.MNTD不受植物生活型影响。植株大小不影响ses.MPD，但解释了ses.MNTD：成熟植物斑块下的土壤细菌群落比贫瘠土壤或幼苗下更为末端聚类。ses.MNTD与植株大小的负相关在各生活型中均得到证实。
土壤肥力和非生物胁迫变量通过两个独立的PCA降维。前两个PC分别解释了78.3%和58.7%的总方差。这些PC分别预测了两种系统发育指标。ses.MPD与PC2.fert负相关，后者与土壤水分相关。矮灌木下的ses.MPD值最高（负值最小），其冠层下土壤水分最低。没有非生物胁迫参数解释ses.MPD的变异。末端系统发育聚类（ses.MNTD）随土壤有机质和养分含量增加而降低，随土壤pH增加而增加。
系统发育群落结构的转变与土壤中主要细菌门（变形菌门和放线菌门）相对丰度的变化相关。两种系统发育多样性指标在变形菌门占优的群落中均降低。该模式由β-变形菌纲（两种指标）和δ-变形菌纲（仅ses.MNTD）的过度代表性驱动。在δ-变形菌纲中，ses.MNTD与粘球菌目（Myxococcales）和互营杆菌目（Syntrophobacterales）的相对丰度负相关。细菌系统发育多样性与放线菌门的相对丰度负相关（ses.MPD）或正相关（ses.MNTD）。对比模式与放线菌门内不同目相关：ses.MPD随放线菌目（Actinomycetales）、土壤红杆菌目（Solirubrobacterales）和候选纲0319-7L14的相对丰度降低，但随红杆菌目（Rubrobacterales）增加；ses.MNTD在红杆菌目和酸微菌目（Acidimicrobiales）占优的群落中增加。
土壤细菌群落在整个演替梯度上普遍存在系统发育聚类，无论在整个系统发育还是仅系统发育尖端，对于所有植物生活型和植物生长阶段均如此。这些结果表明群落由比随机期望更密切关联的类群组成。研究人员检测到原生演替过程中存在显著水平的系统发育聚类，这与随机性作为群落组装早期阶段主要驱动因素的观点相矛盾。支持研究人员的假设，在非生物胁迫下，环境过滤超越随机性，很可能通过允许共享进化保守性状以应对非生物条件的谱系定殖，并过滤掉较不耐胁迫的类群。沿演替梯度，研究人员检测到高水平的系统发育周转率，即与初始群落系统发育距离越来越远的群的大量替换。这种大量周转在13个演替梯度中的10个明显。周转率在考虑整个系统发育时（ses.βMPD）不明显，而是在系统发育尖端（ses.βMNTD）双摄，因为主要的深根谱系存在于整个演替过程中。大的系统发育周转率导致群落组成向由密切相关类群组成的群落转变，表现为系统发育尖端检测到聚类增强。
两种系统发育多样性指标（ses.MPD和ses.MNTD）均揭示显著的系统发育聚类。然而，它们互不相关，并对不同的非生物和生物驱动因素作出响应。MPD反映整个系统发育上的进化相关性，深受深节点分支的主要类群影响，而MNTD测量浅表节点 descended 的末端分支中的相关性。因此，聚类和过度分散模式可能发生在同一生物群落的不同系统发育尺度上。
跨系统发育的聚类强度（ses.MPD）响应植物生活型，与原生演替阶段无关。具体而言，由乔木和多年生草本保育的植物斑块比（矮）灌木庇护更密切相关的土壤细菌。研究人员解释为不同生活型间由于其对土壤水分的差异影响，最可能通过不同的冠层截留水平和减少强烈蒸发而发生。水分是深刻改变土壤微生物群落组成的关键参数。赋予耐干旱性状的微生物特征具有系统发育保守性。实验证据表明，耐旱细菌往往具有更宽的生态位宽度，即为耐受更广土壤水分条件的泛化种，而耐湿细菌往往是局限于湿润条件的特化种。这表明较大的水分水平，通过过度代表共享耐湿条件的微生物，将诱导系统发育聚类。除了作为影响微生物生理状态的资源外，水分还决定土壤基质的物理连通性，这对资源可利用性、土壤生物的活动性和生物相互作用有重要影响。
在细菌系统发育向尖端方向（ses.MNTD），土壤细菌群落随植物生长而越来越聚类，无论植物生活型如何。也就是说，植物发展通过促进近缘共存而加剧了土壤细菌的聚类模式，这与同一生源演替梯度上观察到的分类学多样性增加形成对比。这种变化与细菌群落从裸土到完全发育植被斑块的组成转变相关。具体而言，原生演替早期阶段较高的（但仍强烈聚类的）末端系统发育多样性响应耐热、耐极端辐射、嗜酸性和化能无机营养的放线菌（即红杆菌目和酸微菌目）的过度代表性，与非生物过滤的主导一致。末端系统发育多样性随植物生长而降低，与较大植物下土壤有机碳和养分含量更大正相关。易利用碳输入富集快生长富营养菌，如β-变形菌纲的伯克霍尔德菌目和红环菌目，导致系统发育浅层尺度上的聚类。总体而言，这些结果表明易同化有机碳的脉冲（如根际分泌物提供的脉冲）可能支持由更密切相关类群组成的分类学更多样群落。这种限制性资源的供应可能允许具有相似生态位的类群共存。
出现的最终重要图景是，评估系统发育多样性时分类学尺度很重要。当研究人员试图将系统发育多样性的变化与粗分类尺度的群落组成变化联系起来时，特定谱系根据所考虑系统发育指标的不同表现出对比趋势。放线菌门构成一个显著例子，因为其相对丰度与末端系统发育多样性正相关，但与整个系统发育多样性负相关。在更精细分类尺度上调查此类变化揭示，这两种模式实际上与放线菌门内不同的目相关，其成员在耐非生物胁迫、代谢和竞争能力方面生态上不同。研究人员的结果表明，详细分析特定条件下过度代表的谱系及其对多样性指标的影响，对于理解细菌群落系统发育结构的意义至关重要。
研究结论部分指出：与当前原生演替模型相反，研究人员的数据表明，在严重非生物胁迫下，环境过滤可以超越群落组装早期阶段的随机性。这种过滤产生系统发育多样性的聚类模式，随着演替进行和浅分歧细菌谱系变得越来越密切相关而加剧。这些模式基于整个演替中少数深分歧谱系的富集而产生，这些谱系由众多密切相关的分类单元组成。检查谱系组成对进化相关性指标的影响表明，合作性和竞争性生物相互作用共同支撑群落组装成熟阶段末端系统发育聚类的放大水平。最终，这种系统发育模式的转变可能决定微生物驱动的关键生态系统功能，如分解和养分循环。该研究 exemplifies 如何结合在不同进化尺度上量化相关性的系统发育信息多样性测度，并检验微生物谱系在整个分类层次上对此类指标的影响，从而有助于揭示微生物群落组装的驱动力。
