《Metabarcoding & Metagenomics》：Comparative analysis of eDNA metabarcoding and eDNA metagenomics for fish biodiversity estimates using standard and novel filtration methods
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涉及环境DNA（eDNA）的分子技术越来越多地用于水生物种检测。宏条形码是一种广泛采用的技术，但存在引物偏差：由于引物错配导致物种扩增不均。引物偏差可通过直接测序样本中所有eDNA来消除。这种方法称为（无PCR）宏基因组学，为相对丰度估计提供了潜在优势，但很少
涉及环境DNA（eDNA）的分子技术越来越多地用于水生物种检测。宏条形码是一种广泛采用的技术，但存在引物偏差：由于引物错配导致物种扩增不均。引物偏差可通过直接测序样本中所有eDNA来消除。这种方法称为（无PCR）宏基因组学，为相对丰度估计提供了潜在优势，但很少应用于鱼类群落和eDNA。本研究采用扩展的二乘二设计，比较了多标记Oxford Nanopore Technologies’ (ONT) 宏条形码和ONT宏基因组学（原生测序）在两种过滤类型（常规与粗滤）下的鱼类物种检测。此外，研究人员还探索了从ONT宏基因组学获得的甲基化模式。在受控环境和两个野外环境（其中一个代表捕获-释放场景）中收集了环境DNA。受控环境中存在的所有物种均被宏条形码和宏基因组学检测到。在野外环境中，宏基因组学检测到的物种多于宏条形码。粗滤器在所有测序数据集中恢复了更多物种，但在野外环境的宏条形码中除外。宏条形码和宏基因组学之间的相对读序计数表明，所使用的引物组中存在引物偏差。在所有eDNA样本中，大多数鱼类宏基因组序列被鉴定为欧洲鲟（Acipenser sturio）。研究人员在A. sturio的18S区域上观察到三个碱基修饰，其中三个核苷酸位点在不同eDNA样本之间显示出不同的甲基化模式。研究结果表明，宏条形码和宏基因组学在生物多样性评估中功能互补，宏基因组学提供了碱基修饰的额外见解。此外，粗滤器在多种环境中具有改善物种检测的潜力。
**论文解读**
**研究背景、现存问题与研究目的**
环境DNA（eDNA）技术已成为水生生物监测的重要工具，其中DNA宏条形码（metabarcoding）通过通用引物扩增目标类群，提供物种组成和生物多样性信息。然而，宏条形码存在固有缺陷——引物偏差（primer bias），即因引物结合位点错配导致不同物种扩增效率不均，进而扭曲相对丰度估计。为克服该偏差，研究者提出无PCR的宏基因组学（metagenomics）方法，直接测序水样中所有eDNA，理论上可获得更真实的相对丰度，并额外提供基因组组装、表观遗传修饰（如甲基化）等信息。但宏基因组学在鱼类群落eDNA中的应用仍较少，主要受限于鱼类eDNA在水样中比例极低（通常<1%），需要深度测序。此外，过滤方法直接影响eDNA捕获效率：常规0.45-1.2 μm滤膜易被悬浮物堵塞，限制目标DNA产量；而粗孔径滤膜（如3-6 μm）可能通过保留多细胞生物团块、允许小片段通过，提高目标DNA比例并增大过滤体积。本研究旨在比较多标记ONT宏条形码与ONT宏基因组学在两种过滤类型（常规1.2 μm碟形滤膜 vs. 粗孔香烟滤膜）下的鱼类物种检测能力，并探索宏基因组学中碱基修饰（甲基化）模式的潜在价值。研究在受控环境（鹿特丹动物园鲟鱼水族箱）和野外环境（荷兰Biesbosch自然保护区，含欧洲鲟Acipenser sturio释放场景）中采集水样，分析物种丰富度、相对读序计数、鱼类分类比例及甲基化差异。
**主要技术方法**
研究采用扩展二乘二设计：比较两种技术（多标记ONT宏条形码 vs. ONT宏基因组学）和两种滤膜（常规1.2 μm碟形滤膜 vs. 粗孔香烟滤膜），在水族箱（3条14龄欧洲鲟及6种其他鱼类）和野外（Biesbosch自然保护区，29条16月龄幼鲟释放前/后）共采集15个eDNA样本（含捕获-释放场景）。宏条形码使用三个线粒体标记（MiFish-12S、2kb-12S-16S、Leray-COI）在ONT MinION平台测序；宏基因组学采用ONT原生条形码方案，在PromethION平台深度测序（39.18 Gb），通过Kraken2预筛选鱼类读序，再经BLAST比对至NCBI nt_euk数据库及欧洲鲟参考基因组进行物种鉴定，并调用dorado分析5mC、5mCG、6mA甲基化模式。
**研究结果**
**物种丰富度**：受控环境中，宏条形码检测到15个物种（含所有7个本底种及外源种），宏基因组学检测到8个物种（缺7个低丰度或缺乏参考基因组的物种）；但野外环境中，宏基因组学检测到10个物种，多于宏条形码（5个物种）。两种方法共检出物种存在互补：如宏条形码检出猴虾虎鱼（Neogobius fluviatilis）而宏基因组学未检出，宏基因组学检出黍鲱（Sprattus sprattus）而宏条形码未检出。粗滤膜在受控环境和野外宏基因组学中均恢复更多物种（8 vs. 5；10 vs. 8），但在野外宏条形码中未显示优势。
**相对读序计数**：受控环境中，7个重叠物种的相对读序计数在宏条形码与宏基因组学间存在差异。欧洲鲟在两种技术中均占主导（宏条形码平均72.5%，宏基因组学平均91.1%），但其他物种呈现不同偏差：如星平鲉（Raja brachyura）在宏基因组学中占比更高（6.83% vs. 1.20%），而托氏??（Dasyatis tortonesei）在宏条形码中占比高400倍（11.0% vs. 0.026%），凸显引物偏差及参考基因组缺失的影响。
**鱼类分类比例**：宏条形码中，MiFish标记的鱼类读序比例受滤膜类型影响——粗滤膜在受控环境和野外均显著降低鱼类比例（p<0.05），但增加过滤体积可提升COI标记的鱼类比例。宏基因组学中，受控环境粗滤膜显著提高鱼类读序比例（p=0.0495），而野外相反（粗滤膜比例更低），但最大容量过滤（8.3 L）的粗滤膜鱼类比例（1.57%）高于2 L粗滤膜（0.96%）。捕获-释放场景（Biesbosch水桶）中鱼类比例达4.51%-5.83%。
**可选扩增子与核线粒体DNA片段（NUMTs）**：宏条形码数据中，所有样本的三种标记均存在低百分比同一性（<97%）的Acipenseridae科可选扩增子，经比对至欧洲鲟核基因组HiC_scaffold_1，确认为NUMTs（核线粒体DNA片段）。COI标记中NUMTs比例高达41.4%，严重干扰相对读序计数。
**甲基化模式**：在1761 bp的18S区域上，共检测到5mC、5mCG、6mA甲基化位点分别为123、32、124个，平均甲基化率分别为21.0%、65.4%、0.51%。三个核苷酸位点（AY544133.1:1717、AY544133.1:198、AY544133.1:1677）在不同eDNA样本间显示显著差异甲基化，但成对比较未发现与地点或滤膜类型一致的规律。
**讨论与结论**
讨论部分指出：宏条形码灵敏度较高但受引物偏差和物种掩蔽效应影响，导致野外环境中仅检出5个物种（欧洲鲟占97.71%），而宏基因组学因无PCR扩增，避免了掩蔽，检出10个物种。粗滤膜在受控环境及野外宏基因组学中表现优于常规滤膜，可能因其捕获更长片段（长30%-60%），但野外低目标比例可能与过滤体积不足有关。NUMTs的广泛存在警示宏条形码定量解释需谨慎。甲基化分析虽仅限18S区域，但证明单次宏基因组测序即可同时获取物种多样性与表观遗传信息。
**结论**：宏条形码在物种检测上表现优异，但引物偏差和物种掩蔽会影响本地物种多样性评估，甚至高估物种数。原生测序可作为互补技术，规避宏条形码的固有偏差，并提供甲基化模式等额外信息。粗孔香烟滤膜与3D打印滤器可实现低成本eDNA过滤，在多数场景下提供优于常规1.2 μm滤膜的鱼类群落检测效果。本研究发表在《Metabarcoding》。
