《Microbiological Research》：TvNTPDase4, a surface ectonucleotidase of Trichomonas vaginalis, is a potential immunological marker for the diagnosis of trichomoniasis in women
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滴虫病是全球最常见的非病毒性性传播感染之一，但由于现有诊断方法的局限性，该病仍常被漏诊。核苷三磷酸二磷酸水解酶（nucleoside triphosphate diphosphohydrolase, NTPDase)是阴道毛滴虫（Trichomonas vag
滴虫病是全球最常见的非病毒性性传播感染之一，但由于现有诊断方法的局限性，该病仍常被漏诊。核苷三磷酸二磷酸水解酶（nucleoside triphosphate diphosphohydrolase, NTPDase)是阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）嘌呤补救途径中的关键酶，具有作为诊断靶标的潜力。本研究中，研究人员针对重组蛋白rTvNTPDase4制备了多克隆抗体，并开发并评估了用于尿样中寄生虫检测的间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。该检测方法可检出低至10个滋养体/mL的虫体浓度，且与阴道上皮细胞或代表性泌尿生殖道菌群无交叉反应。临床验证采用73份先前经多重定量聚合酶链反应（multiplex quantitative polymerase chain reaction, multiplex qPCR)分析的女性尿样。在女性样本中，ELISA显示≥99%的灵敏度、100%的特异度，以及1.0的曲线下面积（area under curve, AUC)。免疫荧光技术证实了TvNTPDase4在完整滋养体表面的定位，而纯化的抗TvNTPDase4 IgG对酶活性的抑制作用有限。这些发现表明，基于TvNTPDase4的免疫检测可能是女性尿样中阴道毛滴虫实验室检测的有前景的非侵入性方法。
**研究背景与问题**
滴虫病是由阴道毛滴虫引起的最常见的非病毒性性传播感染（sexually transmitted infection, STI)，全球每年约1.56亿人感染。世界卫生组织数据显示，衣原体、淋病、梅毒和滴虫病常呈无症状状态，每年新增感染约3.74亿例。女性感染者常表现为宫颈炎、排尿困难、阴道分泌物异常及性交痛，而男性则可能出现射精疼痛、排尿困难和烧灼感。更为严重的是，阴道毛滴虫感染可造成上皮损伤并触发炎症反应，招募易感染HIV的细胞，从而增加HIV及其他性传播感染的获得与传播风险；此外还与宫颈和前列腺癌、不孕不育、早产及低出生体重等不良结局相关。然而，约80%的感染者无症状，这限制了主动就医和检测行为。尽管滴虫病具有显著的临床和流行病学影响，但在许多地区仍不属于法定报告传染病，缺乏有效的公共卫生控制政策。
目前，滴虫病主要采用5-硝基咪唑类药物（甲硝唑、替硝唑和塞克硝唑）治疗，但治疗失败日益增多，主要原因包括严重副作用和耐药性的出现。耐药性与诊断延迟及药物的滥用有关，而5-硝基咪唑是唯一获批的治疗药物类别，使得耐药感染患者的替代治疗选择极为有限。
实验室诊断仍以湿片显微镜检查为主，该方法灵敏度低（约50%）。核酸扩增技术（nucleic acid amplification techniques, NAATs)，特别是实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction, qPCR)，被视为检测阴道毛滴虫的金标准，灵敏度显著高于显微镜和培养法。但基于qPCR的检测（如Allplex?试剂盒）因需要专业基础设施和昂贵试剂，在发展中国家和公共卫生筛查场景中尚未普及。因此，开发新的分子靶标以支持改进诊断和治疗策略尤为迫切。
在此背景下，胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶家族（ectonucleotidases of the nucleoside triphosphate diphosphohydrolase family, NTPDases，又称apyrases)成为潜在靶标。NTPDases在二价阳离子（Ca2?或Mg2?）存在下水解核苷三磷酸和二磷酸的γ-和β-磷酸基团。由于阴道毛滴虫缺乏从头嘌呤合成途径，这一水解活性可为寄生虫提供嘌呤核苷酸池所必需的前体。先前研究已在滋养体表面检测到NTPDase活性，并在虫体基因组中鉴定出5个编码TvNTPDases的基因（TvNTPDase1-5)，其中TvNTPDase4表达水平最高。近期研究已将TvNTPDase4在大肠杆菌中异源表达、纯化并进行生化特性分析。
NTPDases作为 promising 的寄生虫抗原受到关注，因其在多种病原体（包括利什曼原虫、曼氏血吸虫和阴道毛滴虫）中为表面暴露酶。除在嘌呤补救途径中的生理功能外，这些酶还可能通过调节胞外腺苷水平参与免疫逃逸。因此，NTPDases是诊断方法开发、特异性抑制剂研发以及寄生虫-宿主相互作用研究的相关靶标。
**研究目的与设计**
基于上述观察，本研究旨在探究TvNTPDase4作为阴道毛滴虫诊断标志物的潜力。研究人员评估了其在间接ELISA中被多克隆IgG识别的能力，利用寄生虫分离株和女性患者尿样进行检测；评价了抗TvNTPDase4抗体对酶活性的抑制效应；并通过免疫荧光技术分析了TvNTPDase4在虫体表面的细胞定位。
**关键技术方法**
本研究采用的主要技术方法包括：生物信息学分析（VaxiJen v2.0抗原性预测、IEDB免疫原性预测、ClustalW2多序列比对、BLASTp相似性分析）；原核异源表达与亲和层析纯化（AKTA Start纯化系统、HisTrap Ni亲和柱）；新西兰兔免疫与Protein G亲和层析纯化抗TvNTPDase4 IgG；点印迹（dot blot）和蛋白质印迹（Western blot）验证抗体特异性；间接ELISA检测体系建立与优化；临床尿样收集自巴西联邦里约格朗德大学药学系临床与毒理分析实验室（LACT）的巴西统一医疗系统（SUS）就诊女性（73份样本，8例qPCR阳性、65例qPCR阴性），样本采集时间为2025年8月至10月；Allplex? multiplex qPCR作为金标准进行方法学验证；孔雀石绿法无机磷酸定量测定NTPDase酶活性；以及间接免疫荧光显微镜观察（Zeiss Axioskop 40荧光显微镜，1000×物镜）。统计分析使用R v.4.3和GraphPad Prism 8.0.2软件。
**研究结果**
**TvNTPDase1-5抗原性与免疫原性的计算预测**：通过生物信息学分析，TvNTPDase3和TvNTPDase4被预测具有抗原性（评分分别为0.621和0.482，阈值0.4）。所有TvNTPDase1-5均被预测为免疫原性（阈值0.5），其中TvNTPDase3（0.70）、TvNTPDase4（0.65）和TvNTPDase5（0.63）评分最高。序列比对显示五种蛋白高度保守，均含有NTPDase/CD39家族特征性的五个apyrase保守区（apyrase-conserved regions, ACRs)。
**抗TvNTPDase4多克隆抗体实现寄生虫检测**：重组rTvNTPDase4在大肠杆菌中成功表达并纯化，SDS-PAGE显示约52.7 kDa单一条带。免疫兔血清在点印迹中显示特异性识别，经亲和层析获得的纯化IgG浓度为1.45 mg/mL。Western blot证实该抗体可识别阴道毛滴虫TVLAC-M15细胞提取物中约52 kDa的内源性TvNTPDase4蛋白。
**抗TvNTPDase4抗体对阴道毛滴虫分离株的增强反应性**：EL韦氏鼠血清滴定显示1:100稀释度信号最强（OD???=2.373）。间接ELISA特异性检测阴道毛滴虫，与胎三毛滴虫（Tritrichomonas foetus）、白色念珠菌（Candida albicans）、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）及HMVII阴道上皮细胞无交叉反应，非靶标生物吸光度未超过约0.500（OD???）。该检测可检出低至0.00097 mg/mL的总蛋白浓度，对临床分离株的检测限低至10个滋养体/mL。人工接种阴道毛滴虫的健康女性尿样显示高灵敏度和特异性，最低检测限约为0.500（OD???），阴性尿样无检测信号。板载稳定性测试显示4°C保存120小时后反应性稳定。
**间接ELISA临床尿样验证**：以73份女性尿样进行临床验证，8例qPCR阳性、65例qPCR阴性。ELISA显示100%特异度、≥99%灵敏度，最佳临界值为0.490，受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC)曲线AUC为1.0（p < 0.0001），Pearson相关系数为1.0。
**抗TvNTPDase4抗体对酶活性抑制有限**：酶活性检测显示，纯化抗TvNTPDase4 IgG对完整活虫的TvNTPDase活性仅产生有限抑制：ATPase、ADPase和AMPase活性分别降低28.8%、26.8%和39.6%。纯化重组酶rTvNTPDase4的ADPase活性在1:100和1:20稀释度下分别仅被抑制9.36%和11.6%。
**TvNTPDase4在阴道毛滴虫中的定位**：间接免疫荧光显示，抗TvNTPDase4抗体可在完整滋养体表面检测到荧光信号，提示TvNTPDase4定位于虫体表面，但不排除其也存在于细胞内区室的可能性。
**讨论与意义**
研究人员在讨论中指出，滴虫病作为被忽视且常被漏诊的性传播感染，其无症状比例高，显微镜诊断灵敏度仅44%-68%，导致大量未治疗感染持续传播。尽管NAATs为诊断金标准，但成本和基础设施要求限制了其在常规临床中的广泛应用，特别是在筛查场景中。因此，需要兼具高灵敏度和特异度的替代实验室方法。
酶联免疫吸附试验因其相对低成本、可扩展性和良好分析性能而被广泛用于传染病诊断。本研究结果支持该平台用于阴道毛滴虫检测的可行性，因为TvNTPDase4能被特异性抗体稳定识别，并可在体外培养的虫株和女性尿样中实现检测。研究人员同时指出，ELISA在临床上的直接应用仍有局限，团队正在开发基于该抗原的即时检测（point-of-care, POC)原型产品。
TvNTPDase1-5作为生物学相关靶标，参与寄生虫嘌呤补救、胞外ATP水解及腺苷生成等关键生物学过程和宿主-寄生虫相互作用。TvNTPDase4与人NTPDases同源性低于30%，这种与宿主蛋白的低同源性对诊断应用尤为重要，可降低交叉反应风险。既往研究已报道其他寄生虫NTPDases的诊断应用价值，如利什曼原虫LiNTPDase2用于犬内脏利什曼病ELISA诊断，曼氏血吸虫SmATPDase1作为血吸虫病生物标志物等。
与其他抗原检测方法相比，本研究开发的间接ELISA在女性尿样中表现出≥99%灵敏度、100%特异度和AUC 1.0的优异性能，检测限低至10个滋养体/mL，优于此前报道的α-actinin ELISA（女性血清学灵敏度52.1%）、阴道分泌物间接ELISA（灵敏度77.4%）以及商业化免疫层析试剂Xenostrip-Tv（灵敏度83-96%，检测限2,500滋养体/mL）。研究同时指出男性滴虫病诊断更具挑战性，因超过75%男性感染者无症状，且虫体负荷常较低且呈间歇性，需进一步研究验证该方法在男性人群中的适用性。
抗体对酶活性抑制有限的现象可归因于五个ACRs位于催化位点但不位于抗原性区域内，抗体结合位点与催化位点不重叠。最高抑制率见于AMPase活性，与先前研究中rTvNTPDase4可水解AMP的结果一致，提示TvNTPDases在单磷酸水解中的作用。
**研究结论**
综上所述，研究人员证实TvNTPDase4具有高抗原性，能够产生并纯化多克隆抗TvNTPDase4抗体。TvNTPDases作为有前景的靶标，不仅可用于治疗应用，还可作为生物技术创新工具用于女性滴虫病的诊断。本研究开发的间接ELISA对女性尿样中的阴道毛滴虫检测具有高度灵敏性和特异性，且未显示与其他微生物、细胞或尿样成分的交叉反应。此外，研究确认TvNTPDase4是表达于阴道毛滴虫表面的酶，且抗TvNTPDase4抗体不能有效抑制其酶活性。基于多克隆抗体/rTvNTPDase4的间接ELISA验证后，即时检测快速诊断原型目前正在该研究组开发中。
