《Environmental and Molecular Mutagenesis》：Benzo[b]fluoranthene Induces Mutation Accumulation and Cancer-Relevant Mutational Signatures in Mouse Lung Alongside Steady State Levels of Chromosome Damage in Blood
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多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）以其致突变性和致癌性而闻名。苯并[b]荧蒽（Benzo[b]fluoranthene, BbF）是美国环境保护署（US Environmental Protection A
多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）以其致突变性和致癌性而闻名。苯并[b]荧蒽（Benzo[b]fluoranthene, BbF）是美国环境保护署（US Environmental Protection Agency, USEPA）因普遍的人类暴露而优先进行毒理学评估的16种PAHs之一。作为多利益相关者联盟的一部分，研究人员通过重复口服灌胃对暴露于五种剂量BbF或溶媒对照的MutaMouse雄性小鼠进行了28、60、90、120或180天的处理，并根据暴露持续时间调整剂量范围，评估了BbF的遗传毒性效应。在28天、90天和180天时间点，使用双链测序（Duplex Sequencing, DS）评估肺组织（n=4）的致突变性，并在所有时间点使用微核试验（micronucleus assay）评估外周血（n=8）的染色体损伤。暴露28、90和180天后，在肺组织中观察到总突变频率（mutation frequency, MF）和C:G > A:T突变的剂量和时间依赖性增加。到28天时，BbF暴露产生了与吸烟相关的肺癌相关突变特征。突变在肺中随时间积累，而外周血红细胞中的染色体损伤在28天时达到稳态。仅对于MF，基准剂量（benchmark dose, BMD）置信区间（confidence intervals, CIs）随暴露时间延长而变窄。总体而言，数据表明BbF是一种强效致突变物，能够在肺中诱导癌症相关突变，支持其在人类肺癌发生中的潜在作用。通过区分早期致突变反应和随时间累积的突变效应，这些发现强调了将致突变性评估整合到延长持续时间研究中的价值，以更好地了解慢性遗传毒性暴露的潜在健康影响。
**论文解读文章**
**研究背景与目的**
多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）是一类广泛存在于环境中的有机污染物，其致突变性和致癌性已被充分认识。苯并[b]荧蒽（Benzo[b]fluoranthene, BbF）是USEPA优先评估的16种PAHs之一，人类通过烟草烟雾、烧烤食物、汽车尾气等途径普遍暴露于此化合物。国际癌症研究机构（IARC）将BbF归类为可能的人类致癌物（Group 2B）。然而，与已被列为已知人类致癌物（Group 1）的苯并[a]芘（benzo[a]pyrene, BaP）相比，BbF的研究相对不足，其致突变和致癌效力的估计存在较大不确定性。现有的遗传毒性测试主要基于定性“是/否”危害识别，缺乏对暴露持续时间如何影响致突变潜力的定量评估。为了更准确地评估慢性遗传毒性暴露的健康风险，需要将致突变性作为毒理学终点进行高精度、定量分析，并考察时间因素对作用点（point of departure）的影响。为此，加拿大卫生部和渥太华大学发起了一项多利益相关方合作研究，旨在评估BbF在不同暴露时间条件下对MutaMouse雄性小鼠多个组织的遗传毒性效应。本论文聚焦于肺组织（已知BbF致癌靶器官）中的突变积累和突变特征，以及外周血中的染色体损伤，探讨BbF的致突变潜力及其与人类肺癌的关联性。该论文发表在《Environmental and Molecular Mutagenesis》。
**主要技术方法**
研究人员采用双链测序（Duplex Sequencing, DS）技术，使用TwinStrand DS Mouse-50 Mutagenesis Panel，对暴露于BbF 28、90和180天的MutaMouse雄性小鼠肺组织（n=4）进行高精度突变频率（MF）和突变谱分析。该Panel覆盖小鼠20条常染色体上的24 kb靶区域（包括基因间和基因内区域），通过错误校正实现单分子级别的突变检测。同时，利用微核试验（micronucleus assay，基于MicroFlowPLUS Kit和流式细胞术）评估外周血红细胞（reticulocytes, RET和normochromatic erythrocytes, NCE）中的染色体损伤，在5个时间点（28、60、90、120、180天）对每组8只小鼠进行分析。此外，采用基准剂量（BMD）建模（PROAST软件）对MF和微核频率进行剂量-反应关系分析，模型平均法生成90%置信区间（CIs）。
**研究结果**
**3.1 DS性能指标**
DS测序获得平均原始读数为4.37×10
8，所有样本均超过5亿个信息性双链碱基，平均靶向深度>10,000×，满足高置信度DS数据标准。文库构建中使用的DNA量（500 ng vs 650 ng）对突变频率或谱无混淆影响。
**3.2 突变频率分析**
在28、90和180天暴露后，BbF均引起MFmin（假设相同突变来自单一事件）的显著剂量依赖性增加。28天和90天时，6.25 mg/kg为最低显著剂量；180天时，3.125 mg/kg即出现显著升高。将相同剂量组的MFmin在不同时间点进行比较，发现BbF暴露小鼠的MFmin随时间呈指数增长，而溶媒对照组呈线性增长（180天显著高于28天）。MFmax与MFmin的差异很小，表明肺组织中未发生明显的克隆扩增。在20个靶区域中，随时间延长，表现出显著MF增加的靶点数量增多（28天12/20，90天18/20，180天全部）。基因间靶点的MFmin显著高于基因内靶点（90和180天差异显著），提示转录偶联修复（transcription coupled repair, TCR）抑制了基因区域的突变。
**3.3 突变谱分析**
BbF暴露主要导致C:G > A:T突变比例增加，呈剂量依赖性：28天最高剂量组占44%，90天占52%，180天占56%。其他突变亚型（如T:A > G:C）在180天时也出现显著增加，同时插入、缺失和多位点变异（MNVs）在180天时呈剂量依赖性升高。溶媒对照组中C:G > T:A占比最高（26-36%），而阳性对照ENU组以T:A > C:G和T:A > A:T为主，表明DS能区分不同作用机制的体内突变。
**3.4 突变特征分析**
三核苷酸突变背景分析显示，C:G > A:T突变主要富集于ACG、CCG和GCG序列背景，180天时TCG背景也增加。通过与COSMIC单碱基替换特征（SBS）进行拟合，发现BbF暴露后主要贡献特征为SBS4（与烟草吸烟相关），在最高剂量组中占比从28天的72.4%增加到180天的87.5%。溶媒对照组则主要呈现时钟样特征SBS1和SBS5，以及年龄相关特征SBS40a/b。余弦相似性聚类分析显示，溶媒对照组与所有BbF处理组完全分离，且低剂量组（1.56-6.25 mg/kg）尽管MFmin变化不显著，但其突变谱已与溶媒对照区分，并逐渐接近高剂量组模式。
**3.5 BbF诱导的染色体损伤**
在所有5个时间点，BbF均引起外周血RET和NCE中微核（MN）频率的显著剂量依赖性增加。28天时效应最强（100 mg/kg组MN-RET升高3.5倍），但随着时间延长和最高剂量降低，MN倍数变化减小。相同剂量下，不同时间点的MN-RET水平相似，表明染色体损伤在28天后达到稳态，未随暴露时间进一步累积（与突变积累模式不同）。溶媒对照组中MN频率随年龄增加不明显。
**3.6 基准剂量分析**
对总MFmin和C:G > A:T MFmin进行BMD建模发现，随着暴露时间延长，BMD置信区间（CIs）变窄且BMD值降低。28天与180天的CIs在C > A突变上完全分离，表明延长暴露提高了致突变效力的估计精度。相比之下，微核终点（MN-RET和MN-NCE）的CIs在不同时间点重叠，未表现出时间依赖性变化，与生物学上可解释的稳态达成一致。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次全面评估BbF（或任何PAH）在小鼠肺内源性DNA靶点上的致突变性，并考察不同暴露时间的影响。主要发现包括：BbF引起肺组织中突变频率的剂量和时间依赖性增加，且180天时可在更低的剂量（3.125 mg/kg）下检测到显著效应，表明延长暴露提高了检测灵敏度。突变呈指数积累而非线性，提示可能存在“残余效应”（adduct carry-over）或代谢限制。基因间与基因内靶点的差异进一步支持TCR的保护作用。C:G > A:T突变的主导地位与BbF代谢物优先与鸟嘌呤反应一致，但肺中的三核苷酸背景与肝脏和骨髓不同，反映了组织特异性代谢。COSMIC SBS4特征的高度贡献将BbF暴露直接与吸烟相关的肺癌突变联系起来，支持其在人类肺癌发生中的作用。研究发现，即使低剂量下MF变化不显著，突变特征分析也能区分暴露组与对照组，凸显了特征分析在检测微弱遗传毒性效应中的价值。外周血微核试验表明染色体损伤在28天后达到稳态，与突变积累形成鲜明对比，这为整合两种终点进行风险评估提供了依据。BMD分析显示，延长暴露可降低致突变效力的BMD值和CIs宽度，这对于确定亚慢性至慢性转换的调整因子（uncertainty factors）具有重要意义。
**结论翻译**
本研究表明，BbF在肺组织中诱导MFmin的剂量和时间依赖性增加，同时在红细胞中引起剂量依赖性微核增加，且后者在不同时间点保持稳定。与先前发现一致，C:G > A:T颠换是BbF在小鼠肺中诱导的主要突变亚型。基因间靶点比基因内靶点表现出更高的MFmin增加，提示转录偶联修复（TCR）在基因区域抑制了致突变作用。BbF诱导的突变显示出与吸烟者肺肿瘤中发现的烟草相关突变特征（SBS4）的强剂量和时间依赖性增加，将BbF暴露与人类肺癌病因联系起来。多时间点实验设计揭示，BbF将肺组织中的突变积累速率从线性函数转变为指数函数，这一现象值得进一步研究。值得注意的是，癌症风险已被证明随年龄呈指数增长。最后，虽然BbF诱导的红细胞染色体损伤效力在不同暴露时间保持一致，但DS显示延长暴露导致肺中突变积累，从而降低了BbF的效力估计值。总之，这些发现强调了将基于突变的终点整合到延长持续时间研究中，以更好地评估遗传毒性危害和效力的价值。
