代谢流分析揭示异养深海细菌分离株中Entner–Doudoroff通路的优势

《Environmental Microbiology Reports》：Metabolic Flux Analysis Reveals Entner–Doudoroff Pathway Dominance in Heterotrophic Deep-Sea Bacterial Isolates

　　

深海微生物通过多样化的代谢策略适应极端条件，然而其胞内碳通量在很大程度上仍未探索。在此，研究人员调查了从太平洋沉积物和深水中分离的四种细菌菌株的中心碳代谢通量，包括Stutzerimonas marianensis PS1、Shewanella piezotolerans WP3、Georhizobium profundi WS11和Parasedimentitalea marina W43。利用多种¹³C标记葡萄糖同位素体进行¹³C代谢流分析（¹³C-MFA），所有菌株优先通过Entner–Doudoroff通路（EDP）降解葡萄糖，其通量占总糖酵解通量的66.7%–94.0%，表明EDP是深海异养生物中保守且占主导的糖酵解途径。S. piezotolerans WP3独特地表现出通过磷酸戊糖途径（PPP）的氧化和非氧化分支的大量通量，表明其前体和氧化还原需求增加。这些菌株还表现出多样的回补策略，利用磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）或丙酮酸羧化作用来补充三羧酸（TCA）循环中间体并提高碳利用效率。氧化应激测定进一步揭示了细胞内能量状态与过氧化氢耐受性之间的联系。总体而言，这些发现为深海细菌的中心碳代谢提供了比较通量组学证据，并突出了支持在碳限制、高压海洋环境中生存的代谢特征。

深海环境是地球上最广泛的栖息地之一，以低温、高静水压和有限的营养供应为特征，这些极端条件驱动微生物发展出多样的代谢活性和适应策略。然而，长期以来，对深海细菌胞内碳通量的定量了解尚属空白。已有的大多数代谢流研究集中于陆地模式生物（如大肠杆菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae），这些物种在葡萄糖分解过程中主要依靠Embden–Meyerhof–Parnas通路（EMPP）和磷酸戊糖途径（PPP），而Entner–Doudoroff通路（EDP）活性极低或缺失。尽管有研究表明近海海水分离菌株广泛依赖EDP，但海底沉积物群落中的EDP作用存在争议，且深海沉积物来源的纯菌株代谢流模式尚未见报道。为此，研究人员开展本研究，旨在通过¹³C代谢流分析（¹³C-MFA）揭示深海异养细菌的中心碳代谢通量分布，并评估这些通量模式与分类特征及潜在适应性之间的关系。该研究工作发表在《Environmental Microbiology Reports》。

研究人员利用四种深海细菌菌株开展研究，包括从马里亚纳海沟沉积物（深度约10 km）分离的Stutzerimonas marianensis PS1、从太平洋沉积物（深度1914 m）分离的Shewanella piezotolerans WP3、从新不列颠海沟沉积物（深度4524 m）分离的Georhizobium profundi WS11以及从新不列颠海沟海水（深度4000 m）分离的Parasedimentitalea marina W43。主要关键技术方法包括：（1）使用三种¹³C标记葡萄糖同位素体（1-¹³C-葡萄糖、U-¹³C₆-葡萄糖与天然葡萄糖的混合物、U-¹³C₆-葡萄糖与1-¹³C-葡萄糖的混合物）进行平行标记培养；（2）通过气相色谱–质谱联用（GC–MS）分析蛋白质氨基酸的质量分布向量（MDV）；（3）利用INCA2.3软件包，结合基于丙氨酸片段的简易方程和并行¹³C标记数据的非线性最小二乘回归，重构包含67个生化反应的代谢网络模型，估算EMP、PPP、EDP、三羧酸（TCA）循环、回补反应及乙醛酸支路等通量；（4）通过Spearman秩相关分析检验生长速率、氧化应激耐受性与代谢通量及能量代谢物浓度的关系。样本来源：四种菌株均从太平洋不同深度（1–10 km）的沉积物或海水中分离，其16S rRNA和全基因组序列已提交至NCBI数据库。

**3.1 Distinct Growth and Substrate Utilisation/Production Rates（差异化的生长与底物利用/生产速率）**
通过生长曲线测定和底物消耗分析，四种菌株在相同碳源（葡萄糖）下表现出显著不同的最大比生长速率（S. marianensis PS1: 0.307 h^?1; S. piezotolerans WP3: 0.059 h^?1; G. profundi WS11: 0.054 h^?1; P. marina W43: 0.084 h^?1），且均呈典型S型曲线。生长速率的差异与温度无关，可能反映了菌株特异的代谢能力和调控策略。能量代谢物（ATP、NADH、NADPH）的测定表明，高生长速率的PS1并未产生最高的ATP或NAD(P)H浓度，且仅生长速率与ATP/NADH通量及胞内浓度存在显著正相关（p < 0.05），提示指数期能量代谢处于动态稳态。

**3.2 ED Pathways as an Important Glycolytic Route for Deep-Sea Microbes（ED通路是深海微生物的重要糖酵解途径）**
通过丙氨酸基方法和INCA流模型两种途径估算糖酵解通量，四种菌株均优先通过EDP利用葡萄糖，EDP通量占总糖酵解通量的66.7%–94.0%。丙氨酸法表明EDP占比>80%，与Klingner等人（2015）报道的近海细菌（81%–95%）一致，但略低，可能反映深海与近海细菌的代谢差异。INCA法进一步确认，四种菌株的EDP与EMPP或PPP并行运作，且所有菌株的基因组注释均缺乏磷酸果糖激酶（phosphofructokinase），因此经典EMPP并非主要糖酵解途径，推断的少量通量可能源于G6P–F6P节点的可逆碳交换。

**3.3 Non-Oxidative Pentose Phosphate Pathway in Genus Shewanella（Shewanella属的非氧化磷酸戊糖途径）**
S. piezotolerans WP3展现出独特的代谢模式，其PPP通量高达25%，且氧化阶段（6PG → RU5P + CO₂）和非氧化阶段（RU5P → X5P）贡献相当，非氧化阶段占PPP总输入通量的57.4%。非氧化PPP是核糖-5-磷酸的重要来源，支持核黄素及DNA/RNA合成。而其他三种菌株的非氧化PPP通量几乎为零，表明核黄素依赖性还原途径可能仅对WP3至关重要。

**3.4 Equivalent Importance of Phosphoenolpyruvate vs. Pyruvate Carboxylation in Anaplerotic Reactions（回补反应中磷酸烯醇式丙酮酸羧化与丙酮酸羧化的同等重要性）**
四种菌株采用两种不同的回补策略：PS1、WS11和W43主要依赖丙酮酸羧化（pyruvate carboxylation）补充TCA循环中间体，而WP3则偏好磷酸烯醇式丙酮酸羧化（PEP carboxylation）。此外，乙醛酸支路（glyoxylate shunt）在四个菌株中均有一定活性（14.8%–36.5%）。这种灵活的回补策略有助于在碳限制环境下维持TCA循环稳态，提高碳利用效率。

**3.5 Metabolic Flux Regulation Against Oxidative Pressure（对抗氧化压力的代谢流调控）**
H₂O₂抗氧化实验表明，抗氧化能力与NADPH供应通量（而非胞内浓度）呈正相关，与ATP水平呈负相关，提示NADPH再生速率是氧化应激防御的关键，而较低的ATP积累或较高ATP周转率有益于抗氧化表现。基因组分析显示，四种菌株均含全局氧化应激调控因子OxyR，但过氧化氢解毒酶基因组成差异显著（PS1含katE、katG、gpx、aphC；WP3含katB、gpx、aphC；WS11和W43仅含katG），表明抗氧化能力受代谢流组织和遗传解毒能力的共同调控。

**结论部分**
论文在讨论中总结：深海异养微生物可能拥有多样的代谢策略以适应低有机质、低温和高静水压环境。本研究通过¹³C-MFA揭示了四种不同水深沉积物分离菌株的中心碳网络胞内通量模式。EDP作为葡萄糖降解的主要糖酵解途径的优势地位，可能代表了微生物在深海沉积物（包括地球最深的马里亚纳海沟）氧化条件下生存的关键策略。涉及丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸羧化的回补途径在四种菌株中表现出显著多样性，进一步为TCA循环和糖异生提供了额外的碳和能量输入。这些代谢特征可能帮助微生物补偿碳限制环境并提高碳利用效率。据研究人员所知，这是首次报道深海微生物的代谢流模式，为其动态代谢过程和适应性策略提供了新见解。