小鼠睾丸中组蛋白同时受到L-乳酰化与D-乳酰化对映异构体修饰

《Molecular & Cellular Proteomics》：Both L-lactyl and D-lactyl enantiomers modify histones in mouse testis

　　

动态性的组蛋白翻译后修饰（PTMs）对于精确编排基因表达程序至关重要。近期发现的组蛋白赖氨酸乳酰化（lactylation）已在多种病理背景中得到探索，但在正常组织中的研究相对较少。该修饰以两种对映异构体形式存在，即L-乳酰化和D-乳酰化；由于糖酵解（glycolysis）产生的L-乳酸更为丰富，前者可能更容易修饰组蛋白。研究人员在此报告，通过蛋白质组学（proteomics）鉴定出小鼠睾丸中组蛋白H3和H4赖氨酸位点上的L-乳酰化和D-乳酰化。研究建立了一种针对组蛋白肽段的靶向蛋白质组学分析方法，采用带有L-或D-乳酰修饰的合成序列，以获得可靠的鉴定与定量数据。部分携带任一对映异构体的组蛋白肽段可通过反相色谱（reversed-phase chromatography）实现分离。有趣的是，尽管在小鼠睾丸中L-乳酸的丰度远高于D-乳酸，研究仍估算出组蛋白H3和H4的7个残基上L-乳酰化相对于D-乳酰化的丰度比介于0.4至1.6之间。随后，研究人员对减数分裂期和减数分裂后雄性生殖细胞（分别为精母细胞和圆形精子细胞）的提取组蛋白进行了靶向蛋白质组学分析；已知这些细胞以L-乳酸作为主要能量来源。尽管如此，组蛋白H3的第18位和第23位赖氨酸（H3K18和H3K23）仍可被可靠定量，并显示两种对映异构体的含量较为均衡。乳酰化在H3和H4全序列范围内的化学计量（stoichiometry）较低，约为0.01%至0.44%；这与乙酰化（acetylation）形成鲜明对比，后者在某些N端赖氨酸上的相对丰度可高达25%–35%。然而，在H3和H4的C端半段，乳酰化似乎比乙酰化更为丰富，因为该区域的乙酰化较为稀少。综上，研究结果提示，体内可能存在一种产生乳酸两种对映异构体混合物的机制，或存在一种更直接的乳酰化底物，从而导致组蛋白同时发生L-乳酰化与D-乳酰化。

该研究发表于《Molecular 》, 聚焦健康组织中组蛋白乳酰化（lactylation）的真实构成及其立体化学来源。研究背景在于，组蛋白翻译后修饰（PTMs）通过调控染色质状态精细控制基因表达，而赖氨酸酰化（lysine acylation）家族的不断扩展，使代谢与表观遗传调控之间的联系成为当前研究热点。乳酰化作为2019年新近提出的修饰，被认为可联系乳酸代谢与转录调控，但既往多数研究集中于肿瘤细胞、缺氧或炎症等病理状态，且通常默认组蛋白主要发生L-乳酰化。这种认识主要基于哺乳动物体内L-乳酸显著高于D-乳酸的代谢事实。然而，健康组织中是否同时存在L-乳酰化与D-乳酰化，两者相对丰度如何，乳酰化与经典乙酰化（acetylation）的定量关系如何，均缺乏直接证据。小鼠睾丸是研究这一问题的理想模型，因为雄性生殖细胞分化过程中伴随剧烈染色质重塑和多波组蛋白修饰变化，且生殖细胞高度依赖乳酸供能，因此该组织特别适合用于考察乳酰化在生理状态下的发生特征与潜在规律。

围绕上述问题，研究人员系统解析了小鼠睾丸组蛋白H3和H4的乳酰化图谱，并特别区分L-与D-乳酰化对映异构体。研究首先通过探索性液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）建立了可能的乳酰化位点分布图谱，随后结合带稳定同位素标记的L-或D-乳酰化合成肽段，构建靶向平行反应监测（PRM）定量策略，以提高鉴定的可靠性并实现对两种对映异构体的相对定量。研究结果表明，小鼠睾丸中组蛋白H3和H4的多个赖氨酸位点同时存在L-乳酰化与D-乳酰化；并且尽管L-乳酸浓度至少比D-乳酸高一个数量级，若干位点上的L/D乳酰化丰度比却接近1，甚至部分位点D-乳酰化更占优势。研究还发现，乳酰化总体化学计量极低，但在H3和H4的C端折叠结构域（histone fold domain）中，其相对丰度可超过乙酰化。该发现的重要意义在于，它直接挑战了“组蛋白乳酰化主要由丰富的L-乳酸驱动”的单一路径认识，提示健康组织中可能存在能够生成两种对映异构底物或更直接乳酰供体的替代机制，也为重新理解代谢物手性（chirality）与染色质修饰之间的关系提供了依据。

作者采用的主要关键技术方法包括：以成年C57BL/6雄性小鼠睾丸为样本来源，并分离获得精母细胞与圆形精子细胞队列；通过酸提取富集组蛋白，结合体外丙酰化（propionylation）-胰蛋白酶消化流程制备适于质谱检测的肽段；利用数据依赖采集（DDA）进行修饰位点探索性筛查，利用平行反应监测（PRM）对特定位点进行定向鉴定与定量；设计并引入带¹³C/¹⁵N标记的L-与D-乳酰化合成肽作为内参，结合反相色谱分离和碎片离子匹配确认对映异构体；同时采用比色法测定睾丸组织中L-与D-乳酸水平。

在研究结果部分，论文首先以“Identification by proteomics of probable lactylation sites on histones H3 and H4 from mouse testis”为题，说明研究人员通过DDA模式下的LC-MS/MS分析，在小鼠睾丸来源组蛋白H3和H4上建立了可能乳酰化位点图谱。研究通过严格审查碎片谱图，要求N端赖氨酸乳酰化肽段具有对应乳酰化赖氨酸环状亚胺离子（cyclic immonium ion）及判别性碎片，从而确认多个候选位点。结果显示，除组蛋白N端区域外，H3K56、H3K64、H3K122、H4K77和H4K91等位点也可见乳酰化信号，提示该修饰不仅存在于伸展的尾部区域，也涉及球状结构域。

在“False identifications of presumably lactylated peptides correspond to propionylated and oxidized sequences, which can be of prevailing abundance”部分，论文指出仅依据72.021 u质量增量不足以确认乳酰化，因为丙酰化联合氧化可形成与乳酰化等质量的假阳性肽段。研究人员通过人工复核MS/MS谱图发现，一些原本被软件标注为乳酰化的肽段，实际上是赖氨酸丙酰化并伴随谷氨酰胺、蛋氨酸、苏氨酸、酪氨酸或组氨酸氧化的产物。这一结果说明，在组蛋白化学衍生化与酸处理条件下，氧化副反应较常见，且其丰度可高于真实乳酰化肽段，因此对碎片离子和保留时间进行严格校验是避免误鉴定的关键。

在“Validating the presence of L-lactylation on H3K18 in mouse testis histones and the necessity to also envision D-lactylation”部分，研究人员引入重标记L-乳酰化合成肽，对H3K18和H3K23位点进行重点验证。结果显示，内源性肽段与合成标准在保留时间和碎片模式上高度匹配，可确证小鼠睾丸中存在H3K18和H3K23的乳酰化。然而，其中一个色谱峰对应的内源性碎片谱呈现混合特征，提示除L-乳酰化外，还可能存在D-乳酰化的同序列同质量肽段。该观察促使研究进一步将对映异构体区分纳入分析框架。

在“Determination of the chromatographic behavior of synthetic peptides from histones H3 and H4 bearing L- or D-lactylated lysines”部分，研究人员进一步合成D-乳酰化肽段，并系统考察L/D对映异构肽在反相色谱中的行为。结果表明，部分来源于H3和H4的乳酰化肽段可在C₁₈色谱柱上实现不同程度的分离，尤其是H3K18、H3K23及H3K56相关肽段。这为后续利用PRM对内源性L-和D-乳酰化进行位点分辨定量提供了技术基础，也证明组蛋白乳酰化对映异构体并非在质谱层面不可区分。

在“Systematic analysis of L- and D-lactylation in histones H3 and H4 from mouse testis and comparison to their acetylated counterparts”部分，论文给出了全研究的核心定量结果。通过对4个生物学重复样本进行靶向分析，研究人员证实H3K18、H3K23、H3K9、H3K56、H3K79及H4K77等位点同时存在L-和D-乳酰化，其中可色谱分离的位点L/D比值介于0.4至1.6。具体而言，H3K18更偏向D-乳酰化，H3K23更偏向L-乳酰化，而H3K9、H3K56和H4K77则呈较平衡状态。值得注意的是，H3K79主要与D-乳酰化信号相吻合。与此同时，研究人员通过比色法测定发现，睾丸中L-乳酸浓度约为1.4 ± 0.16 nmol/mg组织，而D-乳酸接近检测下限，至少比L-乳酸低10倍。这意味着组蛋白上接近均衡的L/D乳酰化并不能由组织内游离乳酸浓度直接解释。随后，作者比较了同一位点乳酰化与乙酰化的相对丰度，发现H3和H4 N端尾部仍以乙酰化占主导，而在组蛋白折叠结构域中，乙酰化极低，乳酰化反而相对更丰富。进一步估算表明，各位点乳酰化化学计量约为0.01%–0.44%，显著低于部分N端赖氨酸上22%–35%的乙酰化，但在若干C端位点可高于乙酰化。

在“Spermatocytes and round spermatids also exhibit histones modified by a racemic mixture of L- and D-lactylation”部分，研究人员将分析对象进一步聚焦于精母细胞和圆形精子细胞这两类主要生殖细胞。尽管样本量较低导致部分位点灵敏度下降，但H3K18和H3K23位点仍可被可靠定量，并显示L-与D-乳酰化呈近似外消旋混合状态。这一结果尤为关键，因为这些细胞已知高度依赖支持细胞提供的L-乳酸作为能量底物，但其组蛋白乳酰化并未表现出明显L型偏向，进一步支持存在其他乳酰化前体或局部代谢来源的观点。

讨论部分强调，本研究首次在健康小鼠组织中以蛋白质组学证据证明组蛋白可同时发生L-乳酰化和D-乳酰化，并指出乳酰化具有两方面特征：其一，位点分布广泛但化学计量极低且相对稳定；其二，与乙酰化相比，乳酰化在组蛋白核心结构域中的相对存在感更强。研究据此认为，既往将组蛋白乳酰化简单归因于L-乳酸富集的框架需要修正。作者进一步指出，未来应探索能否由DJ-1（PARK7）、GLO1/GLO2、醛酮还原酶（AKRs）或醛脱氢酶（ALDHs）等甲基乙二醛（MGO）清除相关系统，在染色质邻域产生L-与D-乳酸混合物或相关中间体；同时，也需进一步判定乳酰化究竟主要通过自发化学反应发生，还是依赖p300、AARS1/2、HBO1、KAT2A等酶促途径。由于乳酰化丰度很低，作者强调未来在研究其基因调控功能时，应并行绘制乳酰化与乙酰化标记的全基因组分布，以避免抗体交叉反应造成的解释偏差。

研究结论可译为：本研究在健康小鼠睾丸中证明，组蛋白H3和H4的多个赖氨酸位点可同时发生L-乳酰化与D-乳酰化。尽管组织中L-乳酸远多于D-乳酸，但两种对映异构体在多个位点上的修饰丰度接近，提示体内可能存在产生两种乳酰化底物混合物的机制，或存在比乳酸更直接的乳酰供体。总体上，乳酰化在H3和H4上的化学计量较低，但在某些C端位点可高于乙酰化。这些发现推动重新审视健康组织中组蛋白乳酰化的形成机制及其潜在调控意义。