Nrf2的下调和TXNIP/NLRP3信号的上调通过海马氧化应激和细胞焦亡诱导术后认知功能障碍

《Neuroscience》：Downregulation of Nrf2 and upregulation of TXNIP/NLRP3 signaling Induce postoperative cognitive dysfunction via oxidative stress and pyroptosis in the hippocampus

　　

术后认知功能障碍（Postoperative Cognitive Dysfunction, POCD）是麻醉和手术后的神经认知并发症，氧化应激是关键病理驱动因素。核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid-related factor 2, Nrf₂）和硫氧还蛋白相互作用蛋白（Thioredoxin-Interacting Protein, TXNIP）是氧化应激和炎症的关键调节因子，且TXNIP直接促进NLRP3炎症小体（NLRP3 inflammasome）活化。研究人员使用通过胫骨骨折手术建立的18月龄小鼠POCD模型，研究了TXNIP表达变化以及Nrf₂/TXNIP/NLRP3信号通路的调控机制。通过Morris水迷宫测试评估认知功能，并分析海马样本中蛋白水平（Nrf₂、TXNIP和NLRP3炎症小体相关蛋白）、促炎因子（IL-1β和IL-18）、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）和神经元凋亡。麻醉/手术显著上调了TXNIP表达。用维拉帕米抑制TXNIP减轻了氧化应激、神经元损伤和NLRP3炎症小体活化，从而改善了认知障碍。类似地，萝卜硫素（sulforaphane, SFN）介导的Nrf₂上调抑制了TXNIP表达，降低了NLRP3炎症小体相关蛋白和促炎因子，并缓解了认知缺陷。这些发现表明，Nrf₂/TXNIP/NLRP3轴介导了POCD发病机制中的海马氧化应激和细胞焦亡，突出了该通路作为潜在治疗靶点。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

术后认知功能障碍（Postoperative Cognitive Dysfunction, POCD）是麻醉和手术后常见的神经认知并发症，表现为记忆衰退、信息处理能力下降及空间定向障碍，尤其在老年患者中发病率高且影响长期生活质量。既往研究已揭示氧化应激和神经炎症是POCD的核心病理机制，但具体的分子通路尚未完全阐明。核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid-related factor 2, Nrf₂）是内源性抗氧化防御的关键转录因子，而硫氧还蛋白相互作用蛋白（Thioredoxin-Interacting Protein, TXNIP）是硫氧还蛋白（TRX）的内源性抑制因子，能够通过释放NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体激活促炎反应。然而，在POCD背景下，Nrf₂与TXNIP/NLRP3轴之间的调控关系及其在氧化应激和细胞焦亡中的作用尚不清楚。本研究旨在利用老年小鼠POCD模型，探讨麻醉/手术如何通过Nrf₂/TXNIP/NLRP3信号驱动海马损伤，并评估靶向该通路的治疗潜力。

**研究内容与结论**

研究人员采用18月龄雄性C57BL/6小鼠（购自SPF（北京）生物技术有限公司），通过七氟烷麻醉下胫骨骨折手术建立POCD模型。实验设计分为三部分：首先验证麻醉/手术诱导的认知缺陷及TXNIP表达变化；其次通过TXNIP抑制剂维拉帕米（verapamil）验证TXNIP/NLRP3通路的致病作用；最后利用Nrf₂激动剂萝卜硫素（SFN）探讨Nrf₂对该通路的调控。认知功能通过Morris水迷宫（MWM）测试评估，海马组织样本用于检测蛋白表达（Western blotting）、基因表达（qRT-PCR）、促炎因子（ELISA）、活性氧（ROS）水平（荧光探针）及神经元凋亡（TUNEL染色）。研究得出以下结论：麻醉/手术通过下调Nrf₂、上调TXNIP，激活NLRP3炎症小体并促进细胞焦亡，导致海马氧化应激和认知障碍；抑制TXNIP或激活Nrf₂均可阻断该通路，改善认知功能，提示Nrf₂/TXNIP/NLRP3轴是POCD的潜在治疗靶点。该论文发表在《Neuroscience》。

**主要关键技术方法**

1. **动物模型与行为评估**：使用18月龄雄性C57BL/6小鼠（来源：SPF（北京）生物技术有限公司），经七氟烷麻醉下行胫骨骨折手术；术后第3-7天进行Morris水迷宫（MWM）训练，第8天进行探查测试，记录逃避潜伏期、目标象限停留时间及穿越平台次数。
2. **分子与生化分析**：采用Western blotting检测海马Nrf₂、TXNIP、NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、GSDMD-N蛋白表达；qRT-PCR检测TXNIP mRNA水平；ELISA测定IL-1β和IL-18浓度。
3. **氧化应激与细胞死亡检测**：利用DCFH-DA荧光探针定量海马总ROS水平；通过TUNEL染色评估神经元凋亡率。
4. **药物干预**：腹腔注射TXNIP抑制剂维拉帕米（10 mg/kg/天，共7天）或Nrf₂激动剂DL-萝卜硫素（SFN，25 mg/kg，术前30分钟单次注射），以验证信号通路功能。

**研究结果**

**1. 麻醉和手术干预诱导老年小鼠认知功能障碍**
通过MWM测试发现，手术组小鼠逃避潜伏期显著延长，目标象限停留时间和平台穿越次数均减少（与对照组相比，第5天逃避潜伏期t=-3.96, P=0.003；目标象限时间t=4.176, P=0.001；平台穿越次数t=3.303, P=0.005），但各组游泳速度无差异，表明运动能力正常。该结果证实麻醉/手术成功建立了POCD模型。

**2. 麻醉和手术诱导小鼠海马TXNIP上调**
Western blotting和qRT-PCR分析显示，手术组海马TXNIP蛋白和mRNA水平显著高于对照组（蛋白：t=-13.568, P<0.001；mRNA：t=-24.641, P<0.001），说明手术创伤与麻醉共同上调了TXNIP表达。

**3. 维拉帕米减轻麻醉和手术后小鼠MWM行为异常**
与S+Saline组相比，S+Verapamil组在第5天逃避潜伏期显著缩短（P=0.005），目标象限停留时间延长（P=0.032），平台穿越次数增加（P=0.038）。C+Saline与C+Verapamil组间无差异，表明维拉帕米通过抑制TXNIP改善了认知功能。

**4. 维拉帕米降低手术老年小鼠TXNIP表达并抑制TXNIP/NLRP3通路激活**
与C+Saline组相比，S+Saline组TXNIP蛋白及mRNA、NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、GSDMD-N蛋白以及IL-1β、IL-18水平均显著升高（P均<0.001或<0.01）。维拉帕米干预（S+Verapamil组）显著下调上述指标（TXNIP蛋白P<0.001，mRNA P<0.001；NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、GSDMD-N分别P<0.001、<0.001、<0.001、=0.005；IL-1β P=0.015，IL-18 P=0.001）。C+Verapamil与C+Saline无差异，提示维拉帕米特异性抑制TXNIP/NLRP3通路。

**5. 抑制TXNIP降低海马总ROS水平和凋亡**
ROS荧光染色显示，S+Saline组海马ROS水平显著高于C+Saline组（P<0.001），而S+Verapamil组ROS较S+Saline组显著降低（P<0.001）。TUNEL染色显示，S+Saline组神经元凋亡率显著增加（与C+Saline比较，P<0.001），而S+Verapamil组凋亡率较S+Saline组显著降低（P=0.002）。C+Saline与C+Verapamil组间无差异，表明TXNIP抑制可减轻氧化应激和神经元死亡。

**6. SFN增强麻醉和手术后小鼠的空间记忆能力**
SFN预处理（S+SFN组）在第5天逃避潜伏期显著短于S+Vehicle组（P=0.025），目标象限停留时间延长（P=0.006），平台穿越次数增加（P=0.041）。各组游泳速度无差异，表明SFN通过激活Nrf₂改善了认知缺陷。

**7. SFN上调Nrf₂抑制手术老年小鼠TXNIP/NLRP3通路**
与C+Vehicle组相比，S+Vehicle组Nrf₂蛋白显著降低（P=0.001），TXNIP、NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、GSDMD-N及IL-1β、IL-18水平均显著升高（P均<0.001或<0.01）。SFN干预（S+SFN组）显著逆转上述变化：Nrf₂上调（P=0.047），TXNIP、NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、GSDMD-N分别降至P<0.001、=0.003、=0.047、<0.001、=0.001；IL-1β和IL-18均降至P<0.001。C+SFN与C+Vehicle组间无差异，证实Nrf₂激活通过抑制TXNIP/NLRP3轴发挥保护作用。

**讨论与结论**

讨论部分指出，POCD的发病核心在于氧化应激与神经炎症的恶性循环。本研究发现麻醉/手术导致海马Nrf₂下调，削弱内源性抗氧化能力，进而引起TXNIP表达升高，后者与TRX解离后激活NLRP3炎症小体，促进caspase-1介导的GSDMD切割和细胞焦亡，释放IL-1β和IL-18，加剧神经炎症和认知障碍。维拉帕米通过抑制TXNIP转录或钙通道阻断，SFN通过激活Nrf₂上调抗氧化酶，两者均有效阻断TXNIP/NLRP3通路。此外，研究讨论了Nrf₂/TXNIP/NLRP3轴与胆碱能抗炎通路（α7nAChR）可能的交互作用，但未直接测定胆碱能标志物。局限性包括仅使用18月龄雄性小鼠，未来需纳入年轻小鼠和雌性模型以验证年龄和性别差异。研究结论：本研究揭示了Nrf₂/TXNIP/NLRP3信号轴通过驱动神经炎症和细胞焦亡介导麻醉/手术诱导的认知功能障碍，该通路是POCD的潜在治疗靶点。