《Neurotherapeutics》：Myelin debris uptake by macrophages and microglia: Resolution of foam cells with a series of novel cyclodextrins
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摘要：多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）病灶中存在富含脂质的泡沫状巨噬细胞，由脱髓鞘后过度吞噬髓鞘碎片（myelin debris）所致。这些载脂巨噬细胞呈促炎表型，抑制髓鞘再生（remyelination），可能参与MS病理进程，但
摘要：多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）病灶中存在富含脂质的泡沫状巨噬细胞，由脱髓鞘后过度吞噬髓鞘碎片（myelin debris）所致。这些载脂巨噬细胞呈促炎表型，抑制髓鞘再生（remyelination），可能参与MS病理进程，但目前尚缺乏针对其的有效治疗策略。本研究旨在明确人与小鼠小胶质细胞/巨噬细胞吞噬髓鞘碎片的时间动力学特征，并建立泡沫状吞噬细胞的体外模型。鉴于环糊精（cyclodextrin, CD）在其他神经系统疾病模型中可促进脂质外流（lipid efflux），研究人员探究了CD作为MS潜在治疗药物的可能性，假设CD可降低泡沫巨噬细胞内脂质蓄积并调节其炎症表型。研究人员评估了数种实验室合成的新型CD。结果显示，长期给予髓鞘碎片联合炎性细胞因子可诱导出具有MS样基因表达特征的炎性巨噬细胞表型（经批量RNA测序验证）。将特定CD施加于体外培养的泡沫巨噬细胞后，摄入及代谢后的脂质蓄积减少，且炎症通路或伤口愈合相关基因的表达发生改变。研究结果表明，CD可调节典型MS病理中的炎性巨噬细胞表型，在MS中具有治疗潜力，值得进一步研究。
论文解读：巨噬细胞与小胶质细胞摄取髓鞘碎片——应用新型环糊精使多发性硬化病灶中泡沫细胞消退
研究背景与目的
多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）是中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）的炎性脱髓鞘疾病，病灶处髓鞘碎片（myelin debris）大量堆积会抑制少突胶质细胞介导的髓鞘再生（remyelination）。小胶质细胞（microglia）与浸润的巨噬细胞（macrophages）吞噬髓鞘碎片本是清除抑制物的有利过程，但持续过量吞噬导致细胞内游离胆固醇在内质网被酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶（Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase, ACAT）酯化为中性脂质，形成脂滴（lipid droplets, LDs）并被油红O（Oil Red O, ORO）染色，细胞转变为泡沫细胞（foam cells / foamy phagocytes）。MS病灶中的泡沫巨噬细胞高表达TNFα、IL-6、IL-1β等促炎因子，吞噬能力下降，并通过NLRP3炎症小体活化及内质网应激（Endoplasmic Reticulum stress, ER stress）加剧病理，是潜在治疗靶点。环糊精（cyclodextrin, CD），特别是2-羟丙基-β-环糊精（2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, HPβCD），在尼曼匹克病C1型（Niemann-Pick Disease Type C1, NPC1）中可促进游离胆固醇从溶酶体外排，但在MS泡沫细胞中清除酯化脂质（esterified lipids）及改善HPβCD耳毒性副作用方面仍有改进空间。本研究由Hotchkiss Brain Institute及Calgary大学临床神经科学系Emily C. Wuerst等开展，发表于《Neurotherapeutics》，旨在：① 表征人与小鼠小胶质细胞/巨噬细胞吞噬髓鞘碎片的时间模式；② 建立炎性泡沫巨噬细胞体外模型；③ 筛选可促泡沫细胞脂质清除并调节表型的新型CD衍生物，以明确CD在MS中的治疗潜能。
主要关键技术方法
研究分离培养C57Bl/6小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDMs）、出生后0–2天CD-1小鼠皮层小胶质细胞及成人脑手术标本来源原代小胶质细胞。通过蔗糖密度梯度离心法制备小鼠脑髓鞘碎片（myelin fragments）。泡沫细胞模型通过髓鞘碎片（60 μg/mL）联合IL-1β（20 ng/mL）与IFNγ（20 ng/mL）刺激3天诱导。测试CD包括市售HPβCD及实验室合成的β-或γ-环糊精衍生物（AC系列、PZ系列）。采用免疫荧光细胞化学检测髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein, MBP）、Filipin（游离胆固醇）、BODIPY/Plin2/ORO（酯化脂质/脂滴）；Amplex Red胆固醇检测试剂盒及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定上清胆固醇；32-或36-plex小鼠细胞因子/趋化因子芯片检测培养上清；高内涵成像系统（ImageXpress Micro XLS）及图像分析软件（MetaXpress、QuPath）进行定量；对泡沫细胞及CD处理后细胞进行批量RNA测序（bulk RNA sequencing），使用Kallisto定量化、DESeq2差异分析、Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行通路富集。统计学采用t检验、单因素/双因素ANOVA及Tukey或Fisher's LSD事后检验。
研究结果
Myelin phagocytosis leads to an initial increase in intracellular myelin and free cholesterol, followed by an accumulation of lipid droplets
小鼠巨噬细胞暴露于髓鞘后6 h（急性相）MBP?及Filipin?（游离胆固醇）信号显著升高，3 d（慢性相）时下降；BODIPY?、Plin2?及ORO?（酯化胆固醇/脂滴）信号在3 d大幅升高，溶酶体（LAMP1?）及细胞（Phalloidin?）面积增大。表明髓鞘被溶酶体降解产生游离胆固醇，随后在内质网酯化形成脂滴，长时间暴露诱导细胞形态呈阿米巴样（ameboid phenotype）。
Characterization of lipid markers following acute and chronic myelin exposure in microglia
小鼠小胶质细胞急性相MBP?及Filipin?升高且3 d仍维持高水平不降，人小胶质细胞模式同小鼠巨噬细胞（3 d Filipin下降），三类细胞均在3 d出现BODIPY?、Plin2?、ORO?脂滴蓄积。说明不同吞噬细胞处理髓鞘脂质时序存在差异，但均形成慢性酯化脂质累积。
Myelin alone is not sufficient to promote an inflammatory macrophage phenotype
单纯髓鞘暴露6 h或3 d，培养上清多数炎性细胞因子/趋化因子与未刺激对照组无显著差异，不足以模拟MS病灶炎性泡沫巨噬细胞，需加入炎性微环境信号。
Myelin and cytokine exposure leads to increased lipid staining, enhanced ameboid morphology and an inflammatory phenotype
髓鞘+IL-1β+IFNγ共刺激3 d，相较于单纯髓鞘组细胞内游离胆固醇（Filipin）、脂滴标记（BODIPY、Plin2）及细胞/溶酶体面积进一步增加；上清IL-6、TNFα、CXCL1、MCP-1（CCL2）、CCL5、MIP-2（CXCL2）等显著升高，具MS样炎性特征，成功建立炎性泡沫巨噬细胞体外模型。
Novel cyclodextrin formulations
合成11种新型CD（β-CD来源：AC3119、AC3147、AC380、PZ7061、PZ7084；γ-CD来源：PZ7086、PZ7095、PZ8059、PZ8061、PZ9078、PZ9080），分子量1884–3171 Da，部分带负电荷侧链，与HPβCD结构不同。
Cyclodextrins reduce intracellular lipid accumulation in microglia and macrophages
髓鞘负载6 h后换液加CD处理24 h，HPβCD及PZ7061、PZ7086、PZ8059（5 mM）显著降低小鼠巨噬细胞BODIPY?比例（对照88%→HPβCD 34%、PZ8059 29%等），不引起细胞死亡；同样处理可使小鼠及人小胶质细胞内BODIPY?脂质减少，证明多种CD可促进髓鞘来源脂质从巨噬细胞和两类小胶质细胞中外排/重分布。
Cyclodextrins reduce lipid content within foamy macrophages
对细胞因子+髓鞘诱导的泡沫巨噬细胞给予CD 48 h，HPβCD、PZ7061、PZ8059（5 mM）及PZ8059（1 mM）显著降低BODIPY?、Plin2?及ORO?细胞百分比，其中γ-CD衍生物PZ8059在降低脂滴密度上优于HPβCD。
CDs sequester cholesterol in cell culture supernatant
Amplex Red法测CD处理组上清胆固醇偏低，因CD直接螯合（sequester）上清胆固醇干扰检测；LC-MS/MS因无法区分游离与CD-胆固醇复合物，亦未显示上清胆固醇明显差异，故未能直接证实外排量，但细胞内脂质标记确证减少。
Cyclodextrin treatment alters gene expression in foamy macrophages
泡沫细胞vs对照上调Cxcl9、Cxcl10、Nos2等炎症基因；HPβCD处理下调经典活化巨噬细胞通路基因，上调Il10、Cxcl12、Vegfa；PZ8059处理下调Ldlr、Dhcr24（脂质代谢相关），转录谱更接近刺激组但部分差异基因涉及伤口愈合相关（Col6a3、Vegfa上调），提示不同CD引起不同基因调控模式。
Pathway analysis
IPA分析显示：刺激组上调MS及M1型经典活化巨噬细胞通路，上游调节子含LPS、IFNγ、TNF；HPβCD处理使上述炎症通路及上游调节子活性降低；PZ8059处理上调伤口愈合（wound healing）通路（含Col6a3、Vegfa、Il1a、Il1b、Tnf）及IL-17信号通路，上游调节子含LPS、TNF、NF-κB、MyD88，较HPβCD更具"激活-修复"表型倾向。
讨论与结论（翻译浓缩）
研究结论：髓鞘碎片吞噬初期游离胆固醇与髓鞘蛋白信号升高，随后酯化脂质与脂滴累积；髓鞘联合炎性细胞因子可诱导出具MS样特征的炎性泡沫巨噬细胞。市售HPβCD及新型CD（尤以γ-CD衍生物PZ7061、PZ7086、PZ8059）可有效降低小鼠巨噬细胞及人/小鼠小胶质细胞内髓鞘来源脂质蓄积。批量RNA测序显示HPβCD逆转泡沫巨噬细胞中部分上调的炎症通路，而PZ8059促进伤口愈合通路活化。泡沫细胞通过持续释放促炎因子及丧失有效吞噬能力阻碍MS修复，CD可通过降低脂质负荷并调节小胶质细胞/巨噬细胞表型在MS中具有治疗潜力。后续需在MS动物模型中验证其对髓鞘再生与修复的影响，为临床转化奠定基础。
