PDE5抑制剂伐地那非(Vardenafil)通过淀粉样β蛋白(Amyloid-β, Aβ)与细胞型朊蛋白(Cellular Prion Protein, PrPC)增强谷氨酸能传递

《Neurotherapeutics》：The PDE5 inhibitor vardenafil enhances glutamatergic transmission through amyloid-beta and cellular prion protein

　　

记忆与突触可塑性受环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)信号通路调控。磷酸二酯酶5(phosphodiesterase 5, PDE5)抑制剂如伐地那非(vardenafil, VDF)可升高细胞内cGMP水平，是有潜力治疗阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)等认知障碍的药物，但PDE5抑制连接兴奋性突触传递的信号通路尚未完全明确，尤其PDE5抑制是否通过淀粉样β蛋白(amyloid-β, Aβ)依赖机制调控谷氨酸能突触仍不清楚。研究人员采用生化、免疫细胞化学及电生理学方法在神经元系统中发现，VDF激活Aβ–细胞型朊蛋白(cellular prion protein, PrPC)依赖的通路，增强突触前谷氨酸能功能。具体而言，VDF升高Aβ水平，导致细胞膜表面PrPC暴露显著减少，该效应可被Aβ生成阻断剂消除。研究人员进一步证实PrPC促进Aβ内化，支持Aβ与PrPC转运间的动态偶联。功能上，VDF选择性增强突触前兴奋性传递——表现为VGLUT1(vesicular glutamate transporter 1)斑点密度增加、微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic current, mEPSC)频率升高，而mEPSC振幅无变化。破坏Aβ–PrPC相互作用则消除上述突触前效应，确立该轴是VDF诱导突触反应的必需中介。综上，本研究揭示了PDE5抑制与Aβ–PrPC依赖的突触前谷氨酸能传递调控之间的功能联系，拓展了Aβ–PrPC信号超出神经毒性的认知框架，强调其在突触调控中的情境依赖性生理作用。

论文解读：

《The PDE5 inhibitor vardenafil enhances glutamatergic transmission through amyloid-beta and cellular prion protein》由Kafi MAA等来自意大利热那亚大学实验医学系的研究人员完成，发表于《Neurotherapeutics》。

【研究背景】

环磷酸鸟苷(cGMP)是调控神经元功能的关键第二信使，其水平受PDE5严格水解调控。PDE5抑制剂（如vardenafil/VDF）可通过升高cGMP改善认知，被视为阿尔茨海默病(AD)潜在治疗药物，但PDE5抑制如何特异性影响兴奋性突触传递的分子机制不明。既往研究发现VDF可促进神经元产生Aβ，而生理浓度Aβ参与突触调节，且可溶性Aβ寡聚体(Aβo)高亲和力结合神经元表面细胞型朊蛋白(PrP^C)，Aβ–PrP^C互作多被研究聚焦于神经毒性，其在生理突触调制中的作用及是否被PDE5抑制所激活均未见报道。因此研究人员开展本研究，探究VDF诱导的Aβ生成是否经PrP^C信号调控基础谷氨酸能传递。

【关键技术方法】

研究使用小鼠神经瘤细胞系Neuro-2a(N2a)及稳定表达人野生型APP695的N2a细胞、胚胎17天(E17)野生型C57BL/6J小鼠原代海马神经元(体外培养13–15天进行实验)；采用PrP^C(Prnp)特异性siRNA敲低、γ-分泌酶抑制剂Compound E(CoE)阻断Aβ生成、抗PrP^C单抗6D11阻断Aβ–PrP^C互作；通过ELISA定量上清Aβ₄₂及PrP^C、免疫印迹检测总PrP^C及生物素化表面蛋白分析膜表面PrP^C、共聚焦免疫荧光观察表面PrP^C及Aβ–FITC内化共定位；以VGLUT1免疫荧光标记评估谷氨酸能突触前终末密度；全细胞膜片钳记录mEPSC；SyGCaMP6s/genetically encoded Ca²⁺indicator靶向突触小泡监测突触前Ca²⁺动态；统计学采用Student t检验或单因素ANOVA及Dunnett事后检验。

【研究结果】

Total expression of PrP^Cand Aβ production are independent processes

PrP^CsiRNA敲低不影响培养上清Aβ₄₂释放量；VDF处理(100 μM, 5 h)显著升高Aβ₄₂但不改变总PrP^C蛋白表达量。结论：PrP^C总量与Aβ生成互不依赖，VDF上调的是Aβ分泌而非PrP^C合成。

VDF reduces PrP^Csurface exposure by stimulating Aβ production

VDF处理1 h使N2a细胞及原代海马神经元表面PrP^C免疫荧光及生物素化膜表面PrP^C显著下降约60%，该下降被CoE预处理完全阻断；APP过表达细胞因基线Aβ升高也呈现表面PrP^C降低而总PrP^C不变，上清未检出可溶性PrP^C排除脱落。结论：VDF通过促进γ-分泌酶依赖的Aβ生成，引起膜表面PrP^C减少（最可能是Aβ结合致PrP^C内吞而非下调合成或脱落）。

Role of PrP^Cin Aβ internalization

培养上清未检出VDF诱导的PrP^C脱落；外源FITC标记Aβ₄₂(Aβ-FITC)与PrP^C在质膜附近共定位，且抗PrP^C抗体6D11预处理使Aβ-FITC内化减少约65%。结论：PrP^C介导Aβ内化摄取，Aβ与PrP^C互作促进其内吞。

VDF increases glutamatergic synaptic density via Aβ peptides

VDF处理使原代海马神经元树突段VGLUT1阳性斑点密度增加约一倍(+103.6%)，该增加被CoE或6D11预处理显著抑制。结论：VDF诱导的谷氨酸能突触前终末密度增加依赖于Aβ生成及Aβ–PrP^C互作。

PDE5 inhibition increases spontaneous glutamate release from presynaptic terminals

全细胞电压钳记录显示VDF使mEPSC频率升高约86%而振幅、上升及衰减时间无变化，表明为突触前效应；CoE完全取消频率升高，6D11部分阻断(~54%)；SyGCaMP6s成像显示VDF增强突触前Ca²⁺响应但不被CoE取消。结论：VDF选择性增强突触前自发谷氨酸释放（增加功能性释放位点数/活性），此效应要求Aβ生成及Aβ–PrP^C互作；VDF还经Aβ非依赖途径增强突触前Ca²⁺动态，两机制部分分离。

【讨论与结论翻译】

本研究确立了药物性PDE5抑制经Aβ–PrP^C互作介导突触前谷氨酸能传递的功能性联系。VDF以Aβ依赖方式降低表面PrP^C并促进VGLUT1斑点密度及mEPSC频率增加，突触后AMPA受体参数不变，呈选择性突触前效应。PrP^C参与Aβ内化；VDF降低表面PrP^C最可能为Aβ结合致PrP^C–Aβ复合物内吞（总PrP^C不变且无胞外脱落）。VDF增强突触前Ca²⁺响应但不依赖Aβ生成，提示PDE5抑制并行激活Aβ–PrP^C依赖（调控释放位点可用性）与Aβ非依赖（增强Ca²⁺动态）的突触前机制。Aβ–PrP^C互作除神经毒性外，可在药理学PDE5抑制条件下参与基础突触传递生理调节。研究所用Aβ为皮摩尔级可溶形式符合生理调质范畴，但长期PDE5抑制对Aβ聚集及斑块的影响需体内研究验证；实验中VDF浓度为机制探索用量高于临床血药浓度，且未做性别分层分析。总之，PDE5抑制激活Aβ–PrP^C依赖机制选择性增强自发突触前谷氨酸能传递，拓展了对PDE5药理与淀粉样蛋白生物学交叉的理解，揭示Aβ–PrP^C信号在基础兴奋性突触功能中具有情境依赖性生理作用。