解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中视黄醇(维生素A/retinol)的可持续微生物生产：从菌株代谢工程到下游制剂配制

《New Biotechnology》：Sustainable microbial production of retinol in Yarrowia lipolytica: From strain engineering to formulation

　　

视黄醇（维生素A）传统上通过化学合成生产，但可持续替代方案日益增长的需求推动了微生物发酵生产的研究兴趣。然而，视黄醇固有的不稳定性使其生物合成及下游处理复杂化，要求采取集成策略进行产物回收与稳定化。本研究报道了首次对微生物发酵产视黄醇进行的纯化与制剂配制。研究人员此前已构建了解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)视黄醇生产菌株，并通过在发酵液中补加吐温80(Tween 80)及抗氧化剂丁基羟基甲苯(BHT)提高了视黄醇回收率。本研究中，通过增加乙酰辅酶A(acetyl-CoA)供给及途径通量，摇瓶条件下视黄醇产量进一步提高了3.2倍。为解决纯化难题，研究人员开发了采用正己烷(n-hexane)和乙醇(ethanol)从胶束(micelle)包裹体系中提取视黄醇的策略，随后再进行两次乙醇萃取。将Tween 80替换为亲水性更强的Tween 20可提高纯化效率。工程菌株在补加Tween 20和BHT的5 L发酵罐中产视黄醇达7.16 g/L，经纯化后视黄醇纯度达48.6%，证明了发酵条件与下游处理协同设计的重要性。研究人员开发了含10%视黄醇的原型制剂，并对其细胞毒性和稳定性进行了验证。生命周期评价(LCA)量化了碳足迹及关键环境贡献因子。综上，本工作建立了结合代谢工程、发酵设计与下游处理的集成方法，以实现视黄醇等不稳定高附加值化合物的可持续微生物生产。

《New Biotechnology》刊载论文解读：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中视黄醇(retinol/vitamin A)的可持续微生物生产——从菌株代谢工程到下游制剂配制

视黄醇（retinol，维生素A）传统依赖化学合成或多步催化路线制备，存在有机溶剂污染及供应链不稳定等问题，微生物发酵法被视为更清洁的替代方案。然而视黄醇具高度光、氧、热不稳定性，且此前研究多聚焦菌株构建与效价(titer)提升，对发酵后下游提取纯化(downstream processing, DSP)及终产品制剂(formulation)研究极少，缺乏从菌种改造、发酵调控到产物精制与商品化制剂的一体化研究。为此，CJ Bio Research Institute研究人员以先前构建的产视黄醇解脂耶氏酵母CJ2104为亲本，通过push-pull代谢工程强化前体乙酰辅酶A(acetyl-CoA)供给与β-胡萝卜素(β-carotene)途径通量，结合亲水性非离子表面活性剂Tween 20辅助胞外分泌，开发正己烷/乙醇胶束破乳-液液萃取工艺，制备10%视黄醇大豆油原型制剂并开展细胞毒、储存稳定性测试及全生命周期评价(Life Cycle Assessment, LCA)，系统论证微生物源视黄醇替代化学合成的可行性。

主要关键技术方法：以解脂耶氏酵母Po1f衍生工程菌株CJ2104为出发菌，通过同源重组进行基因敲除（敲除CAT8、YALI0E15400、CLG1、YEH2、INTF、KU70等）与基因组整合过表达（过表达ERG12-ERG13、HMG1、Hp.GGPPS1、Xd.crtYB、Xd.crtI、MFE1、POT1、PEX10、POX2等），构建最终高产菌株CJ2532；采用5 L发酵罐补料分批发酵(fed-batch fermentation)，培养基补加Tween 20（或Tween 80）与抗氧化剂BHT(butylated hydroxytoluene)；发酵液经碟片离心机澄清获得含视黄醇胶束的渗透液(permeate)，以正己烷单次萃取联合乙醇两次洗涤破胶束提取视黄醇，旋转蒸发后与精炼大豆油混合配制10%(w/w)视黄醇油溶液制剂；采用HPLC-UV定量视黄醇/视黄醛/β-胡萝卜素/角鲨烯(squalene)，全息层析显微镜(holotomography)与拉曼光谱(Raman Spectroscopy)表征胶束及杂质，DiI荧光法检测Tween 20残留；以人真皮成纤维细胞(HDF)MTT法评价制剂细胞毒性，加速与实时条件评估储存稳定性；依据ISO 14040/14044标准以cradle-to-gate边界开展LCA，ecoinvent 3.9.1数据库计算全球变暖潜值(Global Warming Potential, GWP)，副产物菌体按 avoided-burden 法计入单细胞蛋白(Single Cell Protein, SCP)。

3.1. Development of high retinol-producing strains via push and pull strategies

研究人员在CJ2104基础上分步引入MVA途径关键酶ERG12、ERG13（CAT8敲除背景下）及HMG1过表达（YALI0E15400敲除），使摇瓶视黄醇由458.1 mg/L升至557.4 mg/L；再整合Hp.GGPPS1及Xd.crtYB-Xd.crtI（CLG1敲除），效价升至675.9 mg/L；恢复β-氧化关键基因MFE1、POT1、PEX10（YEH2敲除）以增强acetyl-CoA供给，效价提高40.5%达949.3 mg/L且胞内类异戊二烯中间体积累增加；追加Xd.crtYB拷贝（INTF敲除）及恢复POX2（KU70位点整合），最终CJ2532摇瓶效价达1464.2 mg/L，较CJ2104提高3.2倍，5 L发酵罐补Tween 80时总产达6.56 g/L（胞外6.28 g/L），葡萄糖得率0.026 g/g，产率0.054 g/(L·h)。

3.2. Extraction of retinol from the fermentation broth

发酵澄清渗透液含Tween 80-视黄醇胶束，单独正己烷萃取回收率仅36.8%。添加与渗透液等体积乙醇可破坏胶束、促使视黄醇分配至有机相，回收率提升至94.4%，纯度改善至约15.3%；乙酸乙酯+乙醇也可达97.3%回收率但正己烷利于更高纯度，故选用正己烷/乙醇体系。

3.3. Improvement of retinol purity through retinol fermentation with Tween 20 addition

以更高HLB值的Tween 20（HLB=16.7）替代Tween 80进行5 L补料发酵，CJ2532产视黄醇7.16 g/L（胞外6.79 g/L，占94.8%），略优于Tween 80组。Tween 20发酵渗透液经正己烷+乙醇一次萃取回收98.1%、纯度19.6%；二次乙醇洗涤纯度升至29.6%（回收降13%）；三次乙醇洗涤最终纯度48.6%、总回收68.2%；第四次洗涤致纯度与回收双降。残留主要杂质为发酵消泡剂中非离子表面活性剂而非Tween 20。

3.4. Production and evaluation of bio-retinol prototype

将48.6%纯度视黄醇浓缩物与大豆油配制成10%(w/w)视黄醇油制剂（含~1% BHT、微量消泡剂残留、酵母脂质及0.1%视黄醛），拉曼光谱确认视黄醇特征峰与市售品一致。HDF细胞MTT实验显示生物视黄醇与市售品均无显著细胞毒性（1–20 ppm）。4℃避光储存6个月后生物视黄醇保留80.5%（市售品68.8%），25℃及40℃加速降解趋势相似，表明生物视黄醇制剂稳定性与化学合成品相当。

3.5. Life Cycle Assessment (LCA) for bio-retinol formulated from permeate

以cradle-to-gate边界计算生物视黄醇净GWP为99.8 kg CO₂-eq/kg产物（扣除SCP副产avoided burden），主要贡献来自发酵原料——亮氨酸(leucine)占52%、Tween 20占26%，葡萄糖与公用工程占比极小。敏感性分析表明亮氨酸与Tween 20用量各降50%可使GWP分别降至72.1和86.1 kg CO₂-eq/kg，二者均降50%则GWP可减至约41.5 kg CO₂-eq/kg，提示优化昂贵/高碳足迹原料是减碳关键。

讨论与结论（翻译总结）

本研究通过push-pull策略强化MVA途径与β-胡萝卜素途径通量、恢复β-氧化扩增acetyl-CoA库，结合Tween 20介导视黄醇胶束化胞外分泌，实现解脂耶氏酵母5 L发酵罐产视黄醇7.16 g/L。开发正己烷-乙醇胶束破乳萃取可将视黄醇纯化至48.6%并回收68.2%，主要残留杂质为发酵消泡剂来源非离子表面活性剂。配制10%视黄醇大豆油制剂在细胞毒性与4℃储存稳定性上与市售化学合成视黄醇相当。LCA指出过程碳足迹主要受亮氨酸与Tween 20驱动，减量可显著降低GWP。整套集成策略——代谢工程、表面活性剂辅助分泌、简化溶剂萃取、原型制剂评价及环境影响量化——证明微生物发酵视黄醇可作为化学合成视黄醇可信且可持续的替代方案，具备在个人护理、营养保健品及制药领域应用的潜力。