通过甲醇与甲酸共底物补料提升Komagataella phaffii中3-羟基丙酸产量

《New Biotechnology》：Enhancing 3-hydroxypropionic acid production in Komagataella phaffii via methanol and formate co-feeding

　　

Komagataella phaffii是一种极具潜力的细胞工厂，能够利用源自CO?的甲醇（一种可持续的一碳底物）进行化学品生产。研究人员在该菌株中引入β-丙氨酸生物合成途径以及NADP?依赖性甲酸脱氢酶（FDH），使其能够生产平台化学品3-羟基丙酸（3-HP）。研究人员系统探索了甲酸与甲醇（MeOH）共底物补料策略，以增强细胞还原力并改善3-HP生物合成。在摇瓶培养中，采用脉冲式甲酸策略与甲醇联合使用相比于单独使用甲醇，3-HP产量每克甲醇提升高达20.7%（Y_{g3-HP gMeOH}^-1）。该共底物补料策略很可能通过引入的NADP?依赖性FDH催化甲酸氧化，从而增强NADPH的供应能力，进而改善氧化还原平衡，这一机制得到了基于K. phaffii基因组规模代谢模型模拟研究的支持。类似地，在1 L生物反应器规模的重复批次培养中，每4小时进行一次甲酸脉冲可导致Y_{g3-HP gMeOH}^-1提高25.8%，体积生产力相对于不含甲酸的对照组（仅甲醇）提高41%。除补料策略外，pH调控也发挥了关键的作用机制：严格控制pH 5会抑制生长，这是由于未解离甲酸占主导地位所致；而允许pH上升至6-7则有利于解离并支持更高的生产力。这些发现阐明了甲酸同化pH依赖性的本质，并强调了将甲醇与甲酸共利用同动态补料及pH策略相结合以增强K. phaffii生物生产潜力的可能性。

3-羟基丙酸（3-HP）作为重要的平台分子，是丙烯酸、丙烯酰胺、1,3-丙二醇等高价值化学品以及聚（3-羟基丙酸酯）（P3-HP）基可生物降解聚合物的前体，已被美国能源部认定为未来生物基生产中最有价值的平台化学品之一。传统石化路线合成3-HP成本高且环境危害大，而利用可再生资源的微生物生物制造提供了可持续替代方案。甲基营养型酵母Komagataella phaffii（曾名Pichia pastoris）具有可在多种碳源包括甲醇上生长、Crabtree阴性代谢限制副产物形成、以及成熟的合成生物学工具包等优势，已成为3-HP生产的有前景宿主。为实现碳中和生物过程，以一碳底物如CO?和甲醇为原料受到日益关注。甲醇因其液态、高还原电位以及与碳捕获和太阳能储存技术的兼容性而尤为突出，且甲基营养型酵母同化甲醇速率远高于甲基营养型细菌。

甲酸共补料是增强甲醇基过程的策略之一，其作为能量供体通过NAD?连接型FDH支持甲醇代谢并生成NADH。然而，此前关于甲酸补充有益效果的研究在生物反应器规模和K. phaffii中报道有限。甲酸虽具潜力，但会浓度依赖性地抑制酵母生长，不同物种耐受性差异显著。此外，环境背景如碳源类型也影响甲酸耐受性。甲基营养型酵母虽不能在正常生理条件下利用甲酸作为碳源，但通过甘氨酸还原途径已显示出代谢潜力。与此同时，β-丙氨酸途径已成为3-HP合成的有前景路线，该途径将β-丙氨酸转化为丙二酰半醛（MSA），随后使用NADH或NADPH将MSA还原为3-HP。近期该途径已在K. phaffii中引入，在1 L规模补料分批培养中实现了21.4 g L^-1的最终3-HP滴度、0.15 g g^-1的产物得率和迄今报道的最高体积生产力（0.48 g L^-1 h^-1）。该研究还向基础3-HP生产菌株引入了异源NADP依赖性FDH基因以补偿β-丙氨酸途径的NADPH消耗，表明通过甲酸氧化至CO?再生NADPH可增强NADPH供应能力。Wu等人同样鉴定出NADPH供应是甲醇基3-HP生产的重大瓶颈。然而，过程层面改善氧化还原平衡的方法探索相对较少。因此，研究人员假设甲酸共补料可能将甲醇碳流从异化途径转向同化途径，从而增强β-丙氨酸途径的丙酮酸供应。基于此，该研究系统考察了甲酸作为电子供体与甲醇作为唯一碳源共补料对3-HP得率的影响，采用不同甲酸添加策略、操作规模和模式，同时考察pH对过程的影响。

该研究使用的主要关键技术方法包括：以K. phaffii CBS7435来源的工程菌株PpCβ21-P（携带合成β-丙氨酸途径及来自Pseudomonas sp. 101的NADP?依赖性FDH变体）为模型生产菌株；在1 L摇瓶和1.3 L生物反应器中进行批次、补料分批和连续培养；采用脉冲式甲酸添加策略及基于pH的自动甲酸投加策略；利用HPLC（离子交换柱ICSep ICE-COREGEL 87H3，示差折光检测器）定量甲醇、3-HP和甲酸；基于基因组规模代谢模型iMT1026 V3（扩展β-丙氨酸途径和3-HP生产途径）进行约束通量平衡分析（parsimonious FBA），以甲酸和甲醇摄取率为约束评估NADPH周转和3-HP生产通量。

摇瓶培养中甲酸添加对K. phaffii生长和3-HP生产力的影响。研究人员首先考察了甲酸浓度和消耗动力学对K. phaffii生长和3-HP生产的影响。单次0.5 g L^-1甲酸脉冲与两次连续脉冲（0 h和24 h各0.5 g L^-1）的比较表明，第二脉冲的甲酸消耗速率显著提高（至少2.09倍），与生物量增加相关。3-HP对甲醇的得率（Y_P/S）从第一脉冲的0.109 g g^-1提升至第二脉冲的0.165 g g^-1。初始甲酸浓度≥2 g L^-1具有抑制作用。1 g L^-1甲酸条件下的3-HP得率（0.129 g g^-1）较无甲酸对照（0.119 g g^-1）提高10.6%，支持甲酸共补料的有益效果。

甲酸/甲醇比例对摇瓶培养产物得率的影响。研究人员研究了甲醇和甲酸浓度对3-HP每单位甲醇消耗得率（Y_P/S）的影响。固定甲醇（4.6 g L^-1）变化甲酸浓度时，3-HP/甲醇得率从0.121提升至0.146 g g^-1（增幅20.7%）。固定甲酸（0.8 g L^-1）变化甲醇浓度（4.2-7.5 g L^-1）时，3-HP/甲醇得率从0.155提升至0.177 g g^-1（增幅14.2%），相关性更强（R2=0.983）。结果表明甲酸的有益效果在较低甲醇浓度下更有效表达。固定甲醇并变化甲酸的策略被认为更有前景。

1 L生物反应器恒化培养。为验证甲酸共补料对K. phaffii甲醇生物质得率的积极效果，研究人员使用亲本菌株K. phaffii CBS7435进行恒化培养。1:1甲酸:甲醇比例下，与仅甲醇培养相比稳态生物质得率提高11%。使用酸碱pH控制（pH 5）时，甲酸完全同化；而仅碱控制时pH升至7.72，仅30%甲酸被同化，表明仅未解离甲酸可通过被动扩散或未知pH依赖性转运机制进入细胞。对3-HP生产菌株PpCβ21-P的恒化培养观察到相同趋势，仅碱控制下甲醇产物得率仍提高9%。但不同甲酸:甲醇比例下未观察到甲酸同化速率与3-HP生产速率的直接相关性，该培养模式被认为不适合开发甲酸与甲醇共补料的效益。

基于基因组规模模型模拟评估甲酸:甲醇共同化对细胞氧化还原平衡和3-HP生产的影响。研究人员使用iMT1026-v3基因组规模模型评估甲酸:甲醇共同化如何影响3-HP形成和细胞氧化还原需求。在生物质形成为零的参考情况下，最大3-HP通量依赖甲酸和甲醇摄取而非单一底物。引入NADPH依赖性FDH_ps使最大预测v_3-HP提高约5%。在代表生长约束（μ=0.04 h^-1）下，甲酸共补料持续增加预测v_3-HP，最优甲醇/甲酸摄取比与全局氧化还原平衡相关。仅天然FDH时，引入甲酸至最优比例可使v_3-HP提高约34%；同时包含FDH_ps时，最大预测v_3-HP较仅天然FDH情景高约5%。模型预测确立了甲酸共补料代谢影响的机制解释：较高NADPH周转使3-HP生产高于单独甲醇，并支持引入NADPH依赖性FDH_ps的合理性。同株系中NADPH/NADP?比值较亲本株高70%，为遗传改造的功能性提供直接证据。

pH对1 L生物反应器批次培养中甲酸共补料生长和3-HP生产的影响。基于摇瓶和恒化培养结果，将批次过程放大至1 L反应器。pH 5酸碱控制与仅碱控制的比较显示，pH 5时生长受抑，而仅碱控制（pH升至6-7）促进生长和代谢。未解离甲酸浓度在pH 5时约为pH 6时的近十倍，强化其毒性。R4反应器（7.2 g L^-1甲酸，8次脉冲）获得最高得率0.125 g_3-HP g_MeOH^-1、最高生产力0.041 g L^-1 h^-1和最高生物质得率0.455 g_3-HP g_DCW^-1。结果强调pH和甲酸补料策略的重要性，较高pH减少甲酸扩散缓解毒性。

甲酸脉冲策略对1 L生物反应器批次培养生长和3-HP生产的影响。为分离甲酸添加策略的效应，在仅碱pH控制下进行第二组实验。无甲酸对照、每12 h 0.5 g L^-1脉冲（F12h_0.5）、晚期两次脉冲（F_Lp）和每24 h 0.5 g L^-1脉冲（F24h_0.5）的比较表明，F12h_0.5获得最高3-HP生物质得率（Y_P/X=0.535 g_3-HP g_DCW^-1）和最高甲醇得率（Y_P/S=0.105 g_3-HP g_MeOH^-1）。甲酸脉冲使K. phaffii代谢转向增强3-HP生产而牺牲生物质得率，Y_X/S下降约34%，CO?得率上升证实甲酸脉冲有利于氧化代谢促进3-HP合成。累积CO?产量在F12h_0.5中最高（+14.2%）。

1 L生物反应器pH-Stat甲酸补料培养。研究人员提出pH下降触发自动甲酸投加的改进策略。比较pH 5（仅NH?，对照）、pH 6.5和pH 5.5的甲酸调控显示，甲酸调控反应器获得较高3-HP滴度（7.20和7.32 g L^-1）和较低残余甲醇。但pH 6.5响应延迟，甲酸缓冲能力在高pH减弱。进一步在pH 4.75（接近甲酸pKa 3.75）测试，比较连续甲酸pH控制、NH?控制和每4 h 0.5 g L^-1甲酸脉冲（无主动pH控制 urge。甲酸脉冲每4 h策略表现最佳，Y_P/S达0.130 C-mol_3-HP C-mol_MeOH^-1（较pH 4.75 NH?对照提高25.8%），Y_P/X达0.508 C-mol_3-HP C-mol_DCW^-1，体积生产力达0.099 g_3-HP L^-1 h^-1。

研究结论：该研究表明甲酸共补料策略对K. phaffii的3-HP生产具有显著影响。摇瓶培养中，重复甲酸脉冲改善了甲醇和甲酸利用，随着生物量积累培养物生理响应增强。高初始甲酸浓度（2-6 g L^-1）抑制生长，而较低总甲酸供应（1 g L^-1或两次0.5 g L^-1脉冲）改善底物利用并使3-HP得率适度提高最多10.6%。相比之下，贯穿培养的多重甲酸脉冲产生更高的得率改善，达20.7%，甲醇与甲酸比例对效率至关重要。在1 L补料分批生物反应器中，每4小时甲酸脉冲提供最佳性能，体积生产力达0.099 g 3-HP L^-1 h^-1，得率达0.130 C-mol_3-HP C-mol_MeOH^-1（较仅甲醇对照提高25.8%）。总体而言，这些结果表明动态甲酸脉冲是增强K. phaffii中3-HP生产的有效过程策略。研究结果还为优化甲酸驱动共补料过程提供了有用指导，特别是关于脉冲频率和甲醇与甲酸比例方面。